Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

D.T.T. agradece equipe afiliada ao Centro de Biologia Pulmonar da Universidade do Sul do Alabama por estimular discussões sobre as necessidades experimentais de pesquisa de biologia celular. Essas discussões foram cruciais para iniciar o desenvolvimento do ITACS.
Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional de Saúde/Instituto Nacional de Sangue do Coração, P01 HL66299 e R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Alvarez), F32-HL144040-01 (Xu), e da Universidade do Sul do Alabama através do Abraham Mitchell Cancer Research Fund (Singh, Palanki, Tambe), Research and Scholarly Development Grant (Tambe), Honors College, Summer Research Fellow (Nguyen).

<ol>
	<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. 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Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).</li><li>Deforet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+velocity+mapping+of+migrating+cell+populations+(AVeMap).">Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap).</a> Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).</li><li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces.">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li><li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy.">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li><li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+forces+and+kinematics+during+collective+cell+migration.">Mapping forces and kinematics during collective cell migration.</a> Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).</li><li>Charrier, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+make+viscoelastic+polyacrylamide+gels+for+cell+culture+and+traction+force+microscopy.">A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy.</a> APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).</li></ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

As células aderentes usam sinais mecânicos e químicos para sobreviver, crescer e funcionar. Uma grande variedade de softwares de microscopia otimiza a experiência do usuário na avaliação dos sinais químicos através de imagens baseadas em fluorescência. No entanto, a avaliação dos sinais mecânicos envolve capacidades que não estão disponíveis no software padrão de microscopia. Além disso, a avaliação dos sinais mecânicos é mais eficiente quando a aquisição de dados é integrada à análise de dados. A falta de uma plataforma unificada que atenda às necessidades únicas de avaliação de sinais mecânicos tem sido uma grande lacuna tecnológica na biologia celular experimental. O Kit de Ferramentas Integrativas para Analisar Sinais Celulares (iTACS) foi projetado para atender a essa lacuna. Os dois componentes do iTACS, AnViM e AcTrM, equipam os usuários com as capacidades necessárias para quantificar propriedades celulares de quatro grandes categorias: forças, movimento, morfologia e fluorescência/brilho. Nestas categorias, o iTACS é atualmente capaz de revelar mais de 50 aspectos únicos de células aderentes individuais. Esses aspectos compreendem propriedades específicas de cada categoria ampla, incluindo seu valor representativo e variabilidade em toda a célula (Tabela Suplementar S1). Por exemplo, dentro das forças, há forças de tração em todo o citoesqueleto, anisotropia dessa tensão, orientação de tensão máxima e estresse de cisalhamento em toda a interface cell-ECM que tem uma profunda influência no comportamento das células aderentes1,3,6.
Uma nova abordagem para examinar o comportamento mecânico de células individuais de uma monocamada Células individuais de uma monocamada estão envolvidas em uma troca de sinais de natureza química e mecânica3. Estes dois tipos de sinais são transmitidos através da monocamada celular de uma maneira diferente23. No entanto, o conhecimento de transmissão de sinal mecânico fica atrás do da transmissão de sinal químico. Essa lacuna de conhecimento coincide com uma falta sustentada de abordagens simples e intuitivas para avaliar sinais mecânicos celulares. A nova abordagem de mapeamento de dados descrita aqui está equipada para preencher essa lacuna. Tal mapeamento revela que a flutuação da tensão citoesquelética intrínseca na região vizinha de uma célula serve como sinais de relaxamento, fluidização e ancoragem que regulam mudanças na forma, tamanho e velocidade da célula18. Mapas das propriedades das regiões vizinhas exibem padrões de "subdivisão multicelular", onde as células dentro da subdivisão são expostas a um microambiente relativamente uniforme e as células no limite da subdivisão são expostas a um microambiente notavelmente não-universitário18.
Acessibilidade da tecnologia de medição de força Existe uma variedade de protocolos para fazer hidrogéis PAA, analisar a deformação de hidrogel e movimento celular, e quantificar as forças célula-ECM e células-células1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 28,29,30,31,32. No entanto, esses desenvolvimentos permanecem fora do alcance dos laboratórios comuns de biologia celular e confinados a laboratórios com expertise em engenharia. Ao automatizar os aspectos técnicos dessas abordagens e integrá-las sob uma plataforma unificada e fácil de usar, o objetivo do iTACS é tornar a avaliação dos sinais mecânicos uma atividade rotineira na pesquisa e educação em biologia celular experimental.
O ImageJ permite que os usuários desenvolvam aplicativos usando abordagens que exigiriam pouco ou nenhum treinamento11. O iTACS é em grande parte construído usando abordagens simples de scripting para facilitar o desenvolvimento contínuo orientado pela comunidade. Uma grande parte do AcTrM é programado usando scripts BeanShell, e a maior parte do AnViM é programada usando ImageJ Macros. Esses scripts e orientações para implementar esses recursos no microscópio do usuário estão disponíveis através do GitHub (<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>).
Padronização de qualidade das imagens adquiridas Embora as técnicas baseadas em substratos elásticos para quantificar forças físicas em células aderentes tenham sido desenvolvidas e implementadas em vários laboratórios, o protocolo ainda carece de padronização. Uma área que mais precisa ser padronizada é a qualidade das imagens de contas superiores adquiridas (Figura Suplementar S1). Questões significativas surgem da deriva em foco ao longo do experimento. Nossa nova abordagem de refoco baseada em referências de imagem faz de um processo objetivo. Os parâmetros definidos na primeira etapa da AcTrM impõem limites de qualidade objetivo necessários. Outras medidas de padronização podem ser programadas em versões futuras do AcTrM.
A ampla aplicabilidade do iTACS Além de quantificar inúmeros aspectos das células aderentes, a estrutura do iTACS facilita seu uso para vários protocolos e necessidades experimentais. O AcTrM permite o auto-treinamento do usuário guiado por software. Imagens de alta velocidade exigidas, por exemplo, pela avaliação simultânea das flutuações citoplasmáticas de cálcio são atualmente limitadas pela velocidade de reposicionamento e refoco do hardware e é melhor feita em um local de cada vez. No entanto, a implementação atual está bem equipada para imagens de longo prazo, imagens interrompidas, onde a amostra não pode ser retida no estágio do microscópio durante toda a duração do experimento. Uma vez que as imagens de referência são adquiridas no início do experimento, o iTACS permite imagens em tempo real de sinais mecânicos, abrindo novos caminhos em aplicações de triagem de drogas. O AnViM permite que os usuários forneçam informações altamente técnicas em termos leigos. A capacidade de quantificar um amplo espectro de propriedades celulares e rastreá-las ao longo do experimento constitui capacidades críticas necessárias para descobrir novos mecanismos de comunicação intercelulares.
Para o desenvolvimento futuro do iTACS, identificamos quatro áreas focais: (1) aprimoramento da aquisição de dados e da velocidade de análise de dados, (2) implementação de abordagens para avaliar novos sinais celulares13, (3) desenvolvimento de workshops e módulos de educação na avaliação de sinais celulares baseada em iTACS, (4) desenvolvimento de soluções de automação de baixo custo.

Ferramentas de análise óptica e análise de dados comumente usadas empregam tecnologias de hardware e software quase antiquadas. A defasagem na tradução e implementação de avanços em dispositivos eletrônicos, abordagens computacionais e análise matemática em ferramentas comuns de biologia celular experimental é uma grande restrição no ritmo de crescimento em nosso conhecimento da fisiologia celular. Atualmente, pesquisadores de biologia celular encontram ferramentas de biologia molecular ao alcance, mas ferramentas baseadas em princípios de engenharia estão fora de alcance. Uma dessas ferramentas baseadas em princípios de engenharia é a Monolayer Stress Microscopy (MSM)1,2. Embora a MSM tenha sido adaptada e estudada em diversos laboratórios em todo o mundo, seu uso está confinado principalmente a laboratórios com expertise em engenharia3,4,5,6,7,8,9.
O NIH-ImageJ é uma das ferramentas de código aberto mais populares entre os pesquisadores de biologia celular10. Os avanços orientados pela contribuição da comunidade de usuários têm sido centrais para sua popularidade11,12. O ImageJ possui recursos que permitem que os usuários desenvolvam aplicativos com uma mistura de uma linguagem de programação avançada e abordagens simplificadas de script. Esses recursos facilitam os usuários com conhecimento básico de programação para implementar, adaptar e avançar qualquer nova contribuição para o software. Com base nessas qualidades do NIH-ImageJ, desenvolvemos o Integrative Toolkit para Analisar sinais celulares (iTACS), que permite uma integração de baixo custo das ferramentas de hardware e software desejadas para automatizar a medição de uma grande variedade de sinais químicos e mecânicos entre células aderentes11,12.
O iTACS é composto por dois componentes: Módulo de Aquisição e Treinamento (AcTrM) e Módulo de Análise e Visualização (AnViM). O AcTrM é construído no μManager - um aplicativo de aquisição de imagem baseado em NIH-ImageJ - para permitir que os usuários configurem medições de lapso de tempo de propriedades ópticas tradicionais e uma variedade de propriedades físicas de células aderentes em várias amostras12. O AcTrM facilita o treinamento do usuário através de direções concisas incluídas na interface gráfica. Além disso, possui um novo recurso de autofoco baseado em imagem de referência que foi projetado para facilitar medições em tempo real de forças físicas e permitir a padronização da qualidade dos dados adquiridos.
O AnViM é construído sobre plugins ImageJ, software acelerado e scripts de manuseio de arquivos que permitem aos usuários avaliar quantitativamente mais de 50 propriedades, incluindo forma celular, tamanho, orientação, velocidade e direção de movimento, trações exercidas na matriz extracelular (ECM) e em células vizinhas, momentos de contractile e tesoura de ambas as células aderentes individuais e sua região vizinha. O AnViM facilita que os usuários quantifiquem as propriedades físicas celulares sem dominar o fundo técnico subjacente11. Além disso, permite a análise de dados em um modo interativo ou de processamento em lote. Gera mapas de calor revelando variação espacial e gráficos mostrando a variação temporal das propriedades das células individuais.
Em um experimento típico, o usuário cultura células em um hidrogel elástico com proteínas de matriz extracelular apropriadas na superfície superior e dois tipos de marcadores fluorescentes incorporados. Essencialmente, imagens desses marcadores fluorescentes antes e depois de culminar as células são suficientes para quantificar as forças dentro e ao redor de células individuais2,13. O AnViM mapeia esses resultados em células individuais do cluster aderente e gera imagens e gráficos perspicazes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

A avaliação quantitativa das forças celulares e do movimento avançou consideravelmente nas últimas quatro décadas. Esses avanços forneceram a estrutura para examinar processos cricáveis de sinalização mecânica em sistemas de cultura celular. No entanto, o campo enfrenta atualmente três problemas: falta de padronização de qualidade dos dados adquiridos, erros técnicos na análise e visualização de dados, e talvez o mais importante, a tecnologia permanece em grande parte fora do alcance dos laboratórios comuns de biologia celular. Para superar essas limitações, desenvolvemos uma nova plataforma experimental - Kit de Ferramentas Integrativas para Análise de Sinais Celulares (iTACS). O iTACS consiste em dois componentes: Módulo de Aquisição e Treinamento (AcTrM) e Módulo de Análise e Visualização (AnViM). O AcTrM é baseado no μManager - um software de controle de microscópio baseado em NIH-ImageJ - e facilita o auto-treinamento e a automação do usuário de protocolos comuns de aquisição de imagens. O AnViM é baseado no NIH-ImageJ e facilita a automação amigável da análise de dados e visualização criciosa de resultados. Esses experimentos envolvem acultura de células aderentes em hidrogéis, marcadores fiduciais de imagem incorporados no hidrogel, e finalmente extrair dessas imagens uma caracterização mecânica abrangente das células. Atualmente, o iTACS permite que o usuário analise e rastreie uma ampla gama de propriedades, incluindo morfologia, movimento, forças citoesqueletal e fluorescência de células individuais e região vizinha. A questão da padronização da qualidade foi abordada no AcTrM com uma técnica de refoco guiado por imagem de referência. As questões técnicas na análise de dados foram abordadas no AnViM com um procedimento de segmentação de imagens multifacetado, uma abordagem fácil de usar para identificar condições de fronteira e uma nova visualização de dados baseados em propriedades celulares. O AcTrM foi projetado para facilitar a transformação direta de microscópios básicos de fluorescência em plataformas experimentais de mecânica celular, e o AnViM está equipado para permitir que os usuários meçam sinais mecânicos celulares sem exigir um fundo de engenharia. O iTACS estará disponível para a comunidade de pesquisa como um conjunto de código aberto com recursos de desenvolvimento orientados para a comunidade.

Apresentamos aqui duas das principais saídas para o exemplo demonstrado. A primeira saída é o traço de tempo da velocidade celular e da tensão citoesquelético para a célula número 1 (Figura 16). As propriedades são mostradas em um eixo vertical compartilhado para facilitar a associação visual entre as propriedades, e o eixo horizontal indica o número da instância de tempo. Neste experimento, foram adquiridos quadros sucessivos em um intervalo de 15 minutos. A segunda saída é uma matriz de mapas de calor 1 h no experimento (Figura 17). As propriedades aqui mostradas incluem área de disseminação, orientação, circularidade, velocidade, direção de movimento, orientação de tensão máxima, tensão citoesquelletal, traçãos substratos e anisotropia de tensão de células individuais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig01.jpg"> Figura 1: Estrutura do Kit de Ferramentas Integrativas para Análise de Sinais Celulares (iTACS). Dois componentes-chave do iTACS são Módulo de Aquisição e Treinamento (AcTrM) e Módulo de Análise e Visualização (AnViM). AcTrM pode usar várias técnicas de preparação de hidrogel que existem atualmente para preparar hidrogéis que podem ser mantidos firmemente em um estágio de microscópio, qualquer semeadura celular, e um protocolo de crescimento que retém células em um plano focal. O AnViM pode usar várias técnicas para quantificar a deformação de hidrogel e monocamada, forças de células ECM e forças células celulares. Todos esses componentes preferidos pelo usuário do protocolo de medição de força podem ser acomodados no iTACS, e foram identificados com caixas tracejadas. Os componentes identificados com caixas sólidas são novas contribuições para a tecnologia de medição da força celular. A visualização no AnViM se concentra no valor mediano e variabilidade das propriedades em células individuais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig02.jpg"> Figura 2: Aquisição de imagem de referência - parte 1. Etapas para criar uma lista de posições usando AcTrM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig03.jpg"> Figura 3: Aquisição de imagem de referência - parte 2. Etapas para a aquisição de imagens de referência usando AcTrM. As visões detalhadas das etapas 2, 4 e 6 são apresentadas nas Figuras Suplementares S2, S3 e S4, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig04.jpg"> Figura 4: Aquisição automatizada de imagens para o experimento restante. Etapas para retomar a aquisição de imagens para avaliar o comportamento celular usando o AcTrM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig05.jpg"> Figura 5: Configuração automatizada da análise de dados. Etapas para iniciar a análise automatizada de imagens usando o AnViM. O software reconhece o formato de imagem usado pela AcTrM. Uma visão detalhada dos painéis nas etapas 3 e 5 é apresentada nas Figuras Suplementares S5 e Figura Suplementar S6, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig06.jpg"> Figura 6: Quantificação da deformação de hidrogel e monocamadoreira - parte 1. Etapas para engajar, via AnViM, a implementação da Velocimetria de Imagem de Partículas de Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 para quantificar a deformação da superfície superior do hidrogel. Os usuários também podem implementar dentro do AnViM outras abordagens para quantificar a deformação do hidrogel. Uma visão detalhada da etapa 3 é apresentada na Figura Suplementar S7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig07.jpg"> Figura 7: Quantificação da deformação de hidrogel e monocamadora - parte 2. Etapas para engajar, via AnViM, a implementação da Velocimetria de Imagem de Partículas de Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 para quantificar o movimento local de células individuais. Os usuários também podem implementar dentro do AnViM outras abordagens para quantificar o movimento celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig08.jpg"> Figura 8: Quantificação das forças célula-ECM e células-células. Etapas para realizar a análise de imagem para engajar, via AnViM, a implementação da Microscopia de Tração de Quatro Transformações de Trepat et al., Nature Physics (2009)15 para quantificar forças exercidas pelas células no hidrogel, e a implementação da Microscopia de Estresse Monocamada de Tambe et al., Nature Materials (2011)1 para quantificar forças dentro de células individuais e entre células vizinhas. Os usuários também podem implementar dentro do AnViM outras abordagens para quantificar as forças célula-ECM e células-células. Uma visão detalhada da etapa 6 é apresentada em Figura Suplementar S8 e Figura Suplementar S9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig09.jpg"> Figura 9: Mapeando valores de pontos de grade em células individuais - parte 1. Passos para segmentar as regiões de imagem contendo células usando uma nova abordagem multifacetado. Essa abordagem pode ser usada para segmentar imagens de contraste de fase, campo brilhante ou fluorescência das células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig10.jpg"> Figura 10: Mapeamento de valores de pontos de grade em células individuais - parte 2. Passos para segmentar células individuais de uma monocamada usando uma nova abordagem multifacetado desenvolvida no AnViM. Essa abordagem pode ser usada para segmentar imagens de contraste de fase, campo brilhante ou fluorescência das células. Uma visão detalhada da etapa 2 é apresentada na Figura Suplementar S10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig11.jpg"> Figura 11: Mapeamento de valores de pontos de grade em células individuais - parte 3. Etapas para avaliar a intensidade dos pixels na região dentro de células individuais e dentro da região vizinha de células individuais usando OViM. As intensidades avaliadas incluem intensidade de luz transmitida e intensidade de fluorescência. Esta parte mapeia o valor mediano e o desvio padrão das intensidades dos pixels dentro de células individuais e dentro de uma região vizinha de células individuais. Uma visão detalhada da etapa 2 é apresentada na Figura Suplementar S11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig12.jpg"> Figura 12: Mapeamento de valores de pontos de grade em células individuais - parte 4. Etapas para avaliar forças e propriedades de movimento dos pontos de grade dentro de células individuais e dentro da região vizinha de células individuais usando OViM. Esta parte mapeia o valor mediano e o desvio padrão das propriedades dentro de células individuais e dentro de uma região vizinha de células individuais. Uma visão detalhada das etapas 2 e 3 são apresentadas nas Figuras Complementares S12 e Figura Suplementar S13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig13.jpg"> Figura 13: Visualização dos resultados - parte 1. Etapas para rastrear propriedades de células individuais durante toda a duração do experimento usando o AnViM. Uma visão detalhada das etapas 2 e 3 são apresentadas nas Figuras Complementares S14 e Figura Suplementar S15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig13large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig14.jpg"> Figura 14: Visualização dos resultados - parte 2. Etapas para gerar traços de tempo das propriedades avaliadas usando o AnViM. O usuário tem a opção de traçar até três propriedades em um gráfico. Os traços de tempo são gerados para todas as células ou apenas para aquelas células para as quais o rastreamento foi bem sucedido em todo o experimento. Uma visão detalhada da etapa 5 é apresentada na Figura Suplementar S16 e Figura Suplementar S17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig14large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig15.jpg"> Figura 15: Visualização dos resultados - parte 3. Etapas para gerar mapas de calor das propriedades avaliadas usando o AnViM. Mapas de calor são gerados para todos os quadros após o quadro de partida e todas as propriedades selecionadas. Uma visão detalhada da etapa 3 é apresentada na Figura Suplementar S18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig15large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig16.jpg"> Figura 16: Traços de tempo para iD celular 1. Duas propriedades exibidas são a tensão citoesquelético celular ("avgtenMedian") e a velocidade celular ("speedMedian"). Tanto a tensão citoesquelético celular quanto a velocidade celular são quantificadas como o valor médio através dos pontos de grade dentro das células. As duas propriedades são traçadas no mesmo eixo com unidades arbitrárias para visualizar as relações entre as propriedades avaliadas. Nomes de variáveis adicionais estão listados na Tabela Suplementar S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig16large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig17.jpg"> Figura 17: Mapas de calor das propriedades de células individuais através da monocamada analisada. Cada célula é colorida com o valor médio da propriedade indicada no painel. Assim, o vermelho profundo indica o valor celular máximo no espectro de cores, e o azul profundo indica o valor celular mínimo através da monocamada analisada. Como descrito em Tambe et al., PLoS One (2013)2, as células localizadas mais próximas ao limite têm forças mecânicas afetadas por propriedades desconhecidas das células fora da imagem. Assim, o mapa de calor é gerado para células distantes da fronteira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig17large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura S1: Amostrar imagens da conta fluorescente superior e inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S2: Uma visão detalhada do passo 2 da Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s2.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S3: Uma visão detalhada da etapa 4 da Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s3.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S4 A: visão detalhada da etapa 6 da Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s4.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S5: Uma visão detalhada do passo 3 da Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s5.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S6: Uma visão detalhada da etapa 5 da Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s6.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S7: Uma visão detalhada da etapa 3 da Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s7.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S8: Uma visão detalhada da saída de força célula-ECM da etapa 6 da Figura 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s8.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S9: Uma visão detalhada da saída da força celular da etapa 6 da Figura 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s9.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S10: Uma visão detalhada do passo 2 da Figura 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s10.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S11: Uma visão detalhada do passo 2 da Figura 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s11.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S12: Uma visão detalhada do passo 2 da Figura 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s12.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S13: Uma visão detalhada da saída da etapa 3 da Figura 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s13.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S14: Uma visão detalhada do passo 2 na Figura 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s14.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S15: Uma visão detalhada da etapa 3 da Figura 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s15.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S16: Uma visão detalhada dos arquivos de dados gerados na etapa 5 da Figura 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s16.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S17: Uma visão detalhada de uma trama gerada na etapa 5 da Figura 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s17.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura S18: Uma visão detalhada de um mapa de calor e do arquivo contendo a faixa do espectro de cores gerada na etapa 4 da Figura 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s18.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Tabela S1: Uma lista de propriedades selecionadas quantificadas pelo iTACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

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Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

A plataforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiza o processo de medição simultânea de uma grande variedade de sinais químicos e mecânicos em células aderentes. O iTACS foi projetado para facilitar o desenvolvimento orientado pela comunidade e permitir que os pesquisadores usem todos os recursos da plataforma, independentemente de sua formação educacional.

Kit de ferramentas integrativas para analisar sinais celulares: forças, movimento, morfologia e fluorescência

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

As células aderentes exercem forças ao seu redor, e essas forças incluem as forças que as células exercem sobre o substrato, mostrado aqui em verde, e as forças que as células exercem sobre seus vizinhos, mostradas em vermelho. Essas forças podem ser medidas em monocamadas celulares usando uma técnica chamada microscopia de estresse monocamada. Resumidamente, a técnica envolve o preparo de hidrogéis contendo minúsculas contas fluorescentes, logo abaixo da superfície superior, e grandes contas fluorescentes que são coladas ao vidro.Neste hidrogel, vemos as células e culturas delas confluência ou qualquer estado que se deseje medir forças. A medição das forças requer a imagem da monocamada celular, tirando imagens de luz transmitidas das células, e imagens de luz fluorescente das pequenas e grandes contas. Cada uma dessas imagens são adquiridas no mesmo plano vocal.Essas imagens são adquiridas quando as células são anexadas e separadas do hidrogel. E uma comparação desses dois conjuntos de imagens nos fornece os dados necessários para quantificar todas essas forças. É aí que acTrM e AnViM entram em jogo.Depois de emplacar as células, para você adquirir imagens exatamente no mesmo local, em qualquer instância desejada, esse protocolo é programado em AcTrM e, posteriormente, analisar esses dados e visualizar os resultados, esse é o propósito do AnViM. Nos próximos minutos, vamos levá-lo através do processo de aquisição de imagens para uma monocamada de célula de confluência. A etapa zero de ação solicita ao usuário a selecionar o tipo de aquisição.Uma nova aquisição para iniciar um novo experimento, ou uma aquisição contínua para retomar um experimento anterior. Clique em Nova Aquisição para criar uma lista de posições. O primeiro passo da ação lista todos os seus próximos passos.E essas ações serão tomadas na janela de lista de posições de palco aqui. Clique em Live in Micro-Manager para visualizar a amostra para ajustes manuais. Em vista ao vivo, vamos olhar para a fase.Aqui está claro. Agora, é preciso olhar para as contas. Aqui, as contas podem ser visualizadas em fluorescência.Então selecione o canal apropriado para as contas superiores. Também é importante que você seja capaz de ver algumas contas inferiores, então vamos olhar para um canal para as contas inferiores. O que você vê aqui é uma imagem embaçada de contas inferiores, e isso é completamente bom, desde que você possa dizer que as contas inferiores estão lá, o que você pode nesta imagem.Lista de posições, clique em Mark. É assim que você cria uma lista de posições. Depois de criar uma lista de posições, que foi discutida no vídeo anterior, siga os passos listados na segunda etapa de ação usando a janela de aquisição multidimensional.Digamos que queremos fazer um longo lapso de tempo. Aqui, eu vou indicar o número de imagens que queremos ser tiradas. O primeiro canal será o canal de fases.A próxima será das contas de cima e a depois disso serão as contas inferiores. Clique em fechar na janela de aquisição multidimensional e clique em OK na etapa dois do AcTrM. A saída será salva no diretório identificado na janela de aquisição multidimensional.A terceira etapa de ação perguntará se o experimento precisa de recuperação. A resposta normalmente será sim. Aqui pergunta o iTACS, queremos realizar uma recuperação refinada?Esta primeira parte vai nos levar muito perto de uma recuperação refinada, mas a parte inferior vai nos levar ainda mais perto de uma maior precisão de reposicionamento. Se a recuperação for feita usando um campo de visão limitado, esta opção é oferecida, mas para este experimento, não estaremos selecionando essa opção. Neste ponto, a aquisição de um conjunto de imagens de referência está completa e o Micro-Manager pode ser fechado.Para aquisição de imagens, iniciará o AcTrM. Selecione a ampliação e escolha o diretório que contém pastas de dados. Selecione opções para reposicionar a placa junto com o canal usado para reposicionamento.Uma interface é fornecida para combinar o que é visto atualmente na câmera com as imagens salvas. Se houver sobreposição, as imagens exibirão uma cor vermelha e verde junto com a preta, e o ajuste manual pode ser realizado. Caso contrário, a batida aceitar, e a aquisição prosseguirá.Agora podemos começar fiji. Selecione a primeira opção no menu suspenso MSM rotulado de pré-processamento. Em seguida, selecione a pasta que contém a pasta tnimgs.Em seguida, teremos que definir qual canal corresponde a qual imagem. Para este exemplo, o Canal 0 é a imagem de luz transmitida que é a imagem de contraste de fase das células. A imagem inferior da conta é do Canal 2, e a imagem superior é do Canal 1.E então, é perguntar onde as células se cruzam e qual lado da imagem. Neste caso, as células são uma monocamada avançando em direção à borda direita, então vamos desmarcar a direita, e continuar. Aqui uma pequena região de contas superiores, localizada longe da monocamada, servem ao mesmo propósito que as imagens de contas inferiores que parecem mais esparsas e maiores do que as mostradas aqui.Agora está nos perguntando se queremos mudar o brilho e o contraste para que as contas apareçam com destaque. Assim, ajustamos usando as barras de controle deslizante no menu, e uma vez que as contas aparecem proeminentes clique EM OK. E agora, faremos correção de posição. Se houver alguma mudança, ele vai se livrar dele.E depois que for feito, criará a pasta de análise. Dentro da pasta de análise, ele criará a pasta de posição, P0, e as escolhas que fizemos nos menus anteriores de pré-processamento são armazenadas em escolhas de análise, como quais bordas foram cruzadas, tamanho do pixel e qual imagem é contraste de fase e outras. No microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso MSM, selecione deformação de gel MSM.A partir daqui, vamos selecionar a opção que é adequada para a nossa distribuição de contas. E como os dados estão sendo processados, você pode ver que uma nova pasta de deslocamento apareceu na pasta de posição. Este será o lugar onde todos os arquivos de saída serão armazenados.Isso indica que a análise está completa. Vamos ver como calcular as forças que são exercidas através da junção célula-ECM e junção célula-célula e também o citoesqueleto de células individuais da monocamada. Para isso, selecione a terceira opção.E um vai escolher o diretório que contém tnimgs e a pasta de análise, o que significa que se selecionará o diretório de exemplo em vez de qualquer um desses diretórios. Aperte select, e ele vai perguntar-lhe, qual é o módulo de cisalhamento deste gel? O módulo de cisalhamento é de 1250 e a espessura do hidrogel neste exemplo é de 118 mícrons.O nível de ruído antecipado é fornecido aqui. Então, há um deslocamento médio é bandeira zero, que não é verificado neste caso. Selecione OK, e a implementação que calcula a tração é executada através de uma função MATLAB, que é como ela é implementada nesta versão do AnViM.Agora está pronto para fazer o cálculo para células celulares ou forças citoesqueléticos. E a primeira pergunta a se fazer é: a monocamada é confluente? Neste caso em particular, temos uma monocamada avançando e não há uma região celular no lado direito da moldura.Então a resposta é que a monocamada não é confluente, então vamos dizer não. Agora nos pedem para desenhar um polígono em torno do maior objeto não celular. Selecionamos os métodos apropriados para segmentação.Aqui está nos pedindo para indicar a cor das células nos métodos três e quatro, então aqui as células são pretas, então vamos escolher preto. A segmentação produzida a partir desses diferentes métodos termina com alguns buracos na monocamada celular e algumas regiões brancas na área sem células. Aqui podemos escolher, preencher vagas automaticamente e acertar OK.So agora todas as vagas estão preenchidas na monocamada e sem área celular.E então, vamos calcular os estresses mecânicos na monocamada celular. Já realizamos a primeira parte onde segmentamos as células da região sem células, então começamos essa etapa com a parte dois que é a segmentação das células individuais e das imagens. Um deles vai selecionar segmentação para células individuais.E aqui está nos pedindo para escolher o diretório de posições. E há mais informações dadas aqui para esses parâmetros. Então ele pede para desenhar um polígono em torno da menor célula normal.Então o que você desenha aqui é usado para calcular área e vai estipular que qualquer coisa menor do que isso não é definido como uma célula. E depois pede a maior célula. Então desenhamos um polígono em torno da maior célula normal, e então ele pergunta, qual é mais brilhante?A interface celular é mais brilhante ou os centros celulares são mais brilhantes? Então, neste caso, a interface célula-célula é mais brilhante, então eu vou selecionar interface celular-célula. Então isso indica que o cálculo foi concluído.Vamos começar selecionando mapas sobre intensidades de células. Primeiro, o iTACS pede ao usuário para selecionar o diretório de posições, que também é conhecido como pasta P0. Quando terminar, clique em Selecionar.Em seguida, o usuário é perguntado se ele ou ela quer iTACS para detectar divisão celular ou quantificar fluorescência celular. Neste caso, não temos proteínas fluorescentes dentro da célula, então é por isso que optaremos por detectar a divisão celular. O slide seguinte permite que o usuário defina o tamanho da região vizinha, esta é uma análise única que o AnViM realiza onde olha para as propriedades de células individuais, bem como as propriedades das células vizinhas.Aqui, o usuário pode escolher a largura de uma região vizinha de células. Neste caso, definimos as regiões vizinhas com 60 pixels. A primeira caixa de seleção pergunta se queremos que o iTACS colete propriedades das células, sim nós fazemos, e esta caixa de seleção pergunta se queremos que o iTACS recolham propriedades dos vizinhos, sim, queremos que o iTACS faça isso também.Abaixo dessas caixas de seleção, o iTACS fornece mais informações sobre as caixas de seleção se o usuário quiser mais detalhes sobre cada caixa de seleção. Isso indica que a análise está completa. Novamente, o iTACS pede ao usuário para selecionar o diretório de posições.Em seguida, o usuário tem a opção de mapear dados de força, criar imagens dos dados de força, mapear dados de velocidade e criar imagens dos dados de velocidade. É importante notar que criar imagens leva tempo, para que se possa optar por fazê-lo agora ou esperar para fazê-lo mais tarde. É por isso que o usuário tem a opção de selecionar as escolhas ou não.Aqui, o iTACS pede ao usuário que determine o tamanho da região vizinha novamente, e você pode usar o mesmo tamanho que determinou para mapear intensidades, que era de 60 pixels, no nosso caso. E novamente, o usuário é solicitado a coletar propriedades das células, bem como de sua região vizinha. Isso indica que a análise está completa.Na microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso do MSM, selecione os dados de faixa de resultados. Primeiro, o iTACS pede ao usuário para selecionar o diretório de posições, que também é conhecido como pasta P0. Quando terminar, clique em Selecionar.Aqui, o iTACS pergunta a qual número de quadro o usuário deseja que o iTACS comece a rastrear dados. É bastante seguro começar a rastrear a partir do quadro número dois, porque a velocidade não pode ser determinada para o quadro número um. Aqui, o iTACS pede ao usuário que indique o número máximo de parcelas para preencher simultaneamente.E essencialmente, esta é uma maneira de agilizar o rastreamento de dados. Quando terminar, clique em OK e as opções para escolher variáveis durante o rastreamento são apresentadas de forma semelhante às opções de geração de mapas de calor. As propriedades comuns de interesse são fornecidas na caixa de texto na parte superior da janela.Mas se você quiser personalizar suas variáveis, basta excluir tudo na caixa de texto e selecionar as propriedades específicas listadas abaixo. No microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso MSM, selecione o gráfico de resultados. Depois disso, o iTACS pergunta ao usuário se o usuário quer limitar a plotagem para células com faixa ininterrupta.Se você não quiser limitar a plotagem para faixas ininterruptas, clique em No.Mas se você quiser limitar a plotagem para células com faixas ininterruptas, clique em Sim Aqui iTACS pergunta quantas variáveis o usuário quer que o programa plote. O iTACS é capaz de traçar até três variáveis, e neste caso, vamos traçar apenas duas variáveis para ver a relação entre esses fatores. Na microscopia de estresse da monocamada, ou menu suspenso msm, selecione a imagem dos resultados.Aqui está o diretório de posição e, quando concluído, clique em Selecionar. O iTACS então nos pede para escolher o quadro inicial. Aqui, selecionamos o quadro número dois.As opções para fazer mapas térmicos são apresentadas de forma semelhante às opções para traçar faixas de tempo de células individuais. Com isso, concluímos como fazer um mapa de calor. Aqui representa o traço de tempo da velocidade celular na tensão citoesqueleta para a célula número um.As propriedades são mostradas em um eixo vertical compartilhado e o eixo horizontal indica o número da instância de tempo, onde os quadros são adquiridos em intervalos de 15 minutos. A segunda saída é uma matriz de mapas de calor uma hora após o experimento. As propriedades aqui mostradas incluem área de disseminação, orientação, circularidade, velocidade, direção de movimento, orientação de tensão máxima, tensão citoesqueletal, traçãos substratos e anisotropia de tensão de células individuais.Então isso é um vislumbre de um conjunto de experimentos. Existem várias outras situações experimentais em que o AnViM e o AcTrM podem ajudar o usuário a fazer o experimento de forma reprodutível e esses contatos estão listados no manuscrito. Algumas das principais características do iTACS incluem automação do protocolo experimental, análise automatizada de dados e nenhum fundo de engenharia é necessário.

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