Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

D.T.T. благодарит сотрудников, связанных с Центром биологии легких в Университете Южной Алабамы, за стимулирование дискуссий о потребностях экспериментальной клеточной биологии в исследованиях. Эти обсуждения сыграли решающую роль в инициировании разработки iTACS.
Эта работа была частично поддержана грантами Национального института здоровья / Национального института крови сердца легких, P01 HL66299 и R37 HL60024 (Стивенс), R01-HL118334 (Альварес), F32-HL144040-01 (Xu), а также Университета Южной Алабамы через Фонд исследований рака Абрахама Митчелла (Сингх, Паланки, Тамбе), Грант на исследования и научные разработки (Тамбе), Колледж с отличием и Летний научный сотрудник бакалавриата (Нгуен).

<ol>
	<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PloS One. 8 (2), 55172 (2013).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanotransduction+pathway+regulates+collective+migration+of+epithelial+cells.">A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).</li><li>Vedula, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+epithelial+closure+over+non-adherent+environments.">Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments.</a> Nature Communications. 6, 6111 (2015).</li><li>Lamason, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+Sca4+reduces+vinculin-mediated+intercellular+tension+to+promote+spread.">Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread.</a> Cell. 167 (3), 670-683 (2016).</li><li>Sunyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Dong, L., Oberai, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+cellular+traction+in+three-dimensional+nonlinear+hyperelastic+matrices.">Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices.</a> Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).</li><li>Nier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalman+inversion+stress+microscopy.">Kalman inversion stress microscopy.</a> Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).</li><li>Serrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Monolayer+Stress+Microscopy.">Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy.</a> Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+Image+Analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 20 (2010).</li><li>Patel, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+shear:+Role+of+intercellular+traction+and+cellular+moments+in+collective+cell+migration.">Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+complaint+matrices+for+quantifying+cellular+contraction.">Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Patel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+in+a+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+monolayer.">Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).</li><li>K&#228;hler, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+results+of+the+4th+International+PIV+Challenge.">Main results of the 4th International PIV Challenge.</a> Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Alvarez-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-layer+elastographic+3-D+traction+force+microscopy.">Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 39315 (2017).</li><li>Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+traction+force+microscopy.">Holographic traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3038 (2018).</li><li>Janmey, P. A., Miller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanical+signaling+in+development+and+disease.">Mechanisms of mechanical signaling in development and disease.</a> Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).</li><li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method.">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Saez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+exerted+by+epithelial+cell+sheets.">Traction forces exerted by epithelial cell sheets.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).</li><li>Deforet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+velocity+mapping+of+migrating+cell+populations+(AVeMap).">Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap).</a> Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).</li><li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces.">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li><li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy.">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li><li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+forces+and+kinematics+during+collective+cell+migration.">Mapping forces and kinematics during collective cell migration.</a> Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).</li><li>Charrier, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+make+viscoelastic+polyacrylamide+gels+for+cell+culture+and+traction+force+microscopy.">A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy.</a> APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Адгезивные клетки используют как механические, так и химические сигналы, чтобы выжить, расти и функционировать. Широкий спектр программного обеспечения для микроскопии оптимизирует пользовательский опыт при оценке химических сигналов с помощью флуоресцентной визуализации. Однако оценка механических сигналов включает в себя возможности, которые недоступны в стандартном программном обеспечении для микроскопии. Кроме того, оценка механических сигналов наиболее эффективна, когда сбор данных интегрирован с анализом данных. Отсутствие единой платформы, отвечающей уникальным потребностям оценки механических сигналов, стало серьезным технологическим пробелом в экспериментальной клеточной биологии. Интегративный инструментарий для анализа клеточных сигналов (iTACS) предназначен для устранения этого пробела. Два компонента iTACS, AnViM и AcTrM, предоставляют пользователям необходимые возможности для количественной оценки клеточных свойств четырех широких категорий: силы, движение, морфология и флуоресценция/яркость. В этих категориях iTACS в настоящее время способен выявить более 50 уникальных аспектов отдельных адгезивных клеток. Эти аспекты включают специфические свойства каждой широкой категории, включая их репрезентативное значение и изменчивость по ячейке (Дополнительная таблица S1). Например, внутри сил существуют силы растяжения через цитоскелет, анизотропия этого напряжения, ориентация максимального напряжения и напряжение сдвига через границу раздела клетка-ECM, что оказывает глубокое влияние на поведение адгезивных клеток1,3,6.
Новый подход к исследованию механического поведения отдельных клеток монослоя Отдельные клетки монослоя занимаются обменом сигналами химической и механической природы3. Эти два типа сигналов передаются по сотовому монослою по-разному23. Однако знания о механической передаче сигнала отстают от знаний о химической передаче сигнала. Этот пробел в знаниях совпадает с устойчивым отсутствием простых и интуитивно понятных подходов к оценке клеточных механических сигналов. Новый подход к картированию данных, описанный здесь, оснащен для заполнения этого пробела. Такое картирование показывает, что флуктуация внутреннего цитоскелетного напряжения в соседней области клетки служит релаксацией, флюидизацией и закреплением сигналов, которые регулируют изменения клеточной формы, размера и скорости клетки18. Карты свойств соседних областей демонстрируют паттерны «многоклеточного деления», где клетки внутри подразделения подвергаются воздействию относительно однородной микросреды, а клетки на границе деления подвергаются воздействию удивительно неоднородной микросреды18.
Доступность технологии измерения силы Существует множество протоколов для создания гидрогелей PAA, анализа деформации гидрогеля и клеточного движения, а также количественной оценки клеточно-ECM и клеточно-клеточных сил1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 ,28,29,30,31,32. Тем не менее, эти разработки остаются вне досягаемости обычных лабораторий клеточной биологии и ограничены лабораториями с инженерным опытом. Автоматизируя технические аспекты этих подходов и интегрируя их в единую и удобную для пользователя платформу, цель iTACS состоит в том, чтобы сделать оценку механических сигналов рутинной деятельностью в экспериментальных исследованиях и образовании в области клеточной биологии.
ImageJ позволяет пользователям разрабатывать приложения, используя подходы, которые потребуют небольшого обучения или вообще не потребуют его обучения11. iTACS в значительной степени построен с использованием простых подходов к написанию сценариев для содействия непрерывному развитию, ориентированному на сообщество. Большая часть AcTrM программируется с помощью скриптов BeanShell, а основная часть AnViM программируется с помощью макросов ImageJ. Эти скрипты и руководства по реализации этих возможностей на микроскопе пользователя доступны через GitHub (<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>).
Стандартизация качества получаемых изображений Хотя методы количественной оценки физических сил в адгезивных клетках на основе упругого субстрата были разработаны и внедрены в различных лабораториях, протоколу все еще не хватает стандартизации. Одной из областей, которая больше всего нуждается в стандартизации, является качество полученных изображений верхнего бисера (дополнительный рисунок S1). Значительные проблемы возникают из-за дрейфа в фокусе на протяжении всего эксперимента. Наш новый подход к перефокусировке на основе эталонных изображений делает такое сосредоточение объективным процессом. Параметры, определенные на самом первом этапе AcTrM, накладывают необходимые объективные ограничения качества. Другие меры по стандартизации могут быть запрограммированы в будущих версиях AcTrM.
Широкая применимость iTACS В дополнение к количественной оценке многочисленных аспектов адгезивных клеток, структура iTACS облегчает его использование для различных экспериментальных протоколов и потребностей. AcTrM позволяет программно управлять самообучением пользователей. Высокоскоростная визуализация, необходимая, например, для одновременной оценки колебаний цитоплазматического кальция, в настоящее время ограничена скоростью перепозиционирования и перефокусировки оборудования и лучше всего выполняется в одном месте за раз. Однако текущая реализация хорошо оснащена для долгосрочной визуализации, прерванной визуализации, где образец не может быть сохранен на стадии микроскопа в течение всего периода эксперимента. Поскольку эталонные изображения получены в начале эксперимента, iTACS позволяет визуализировать механические сигналы в режиме реального времени, открывая новые возможности в приложениях для скрининга лекарств. AnViM позволяет пользователям предоставлять высокотехническую информацию в терминах непрофессионала. Способность количественно оценивать широкий спектр клеточных свойств и отслеживать их на протяжении всего эксперимента представляет собой критические возможности, необходимые для открытия новых механизмов межклеточной связи.
Для будущего развития iTACS мы определили четыре основных направления: (1) повышение скорости сбора и анализа данных, (2) внедрение подходов к оценке новых сотовых сигналов13, (3) разработка семинаров и учебных модулей по оценке сотового сигнала на основе iTACS, (4) разработка недорогих решений автоматизации.

Широко используемые оптические инструменты визуализации и анализа данных используют аппаратные и программные технологии, которые почти устарели. Отставание в переводе и внедрении достижений в области электронных устройств, вычислительных подходов и математического анализа в общие экспериментальные инструменты клеточной биологии является основным ограничением темпов роста наших знаний о клеточной физиологии. В настоящее время исследователи клеточной биологии находят инструменты молекулярной биологии в пределах досягаемости, но инструменты, основанные на инженерных принципах, находятся вне досягаемости. Одним из таких инструментов, основанных на инженерных принципах, является монослойная стрессовая микроскопия (МСМ)1,2. В то время как МСМ был адаптирован и изучен в различных лабораториях по всему миру, его использование в основном ограничено лабораториями с инженерным опытом3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ является одним из самых популярных инструментов с открытым исходным кодом среди исследователей клеточной биологии10. Достижения, основанные на вкладе сообщества пользователей, были центральными для его популярности11,12. ImageJ имеет функции, которые позволяют пользователям разрабатывать приложения с сочетанием передового языка программирования и упрощенных подходов к написанию сценариев. Эти функции помогают пользователям с базовыми знаниями в области программирования внедрять, адаптировать и продвигать любой новый вклад в программное обеспечение. Основываясь на этих качествах NIH-ImageJ, мы разработали Интегративный инструментарий для анализа клеточных сигналов (iTACS), который обеспечивает недорогую интеграцию необходимых аппаратных и программных средств для автоматизации измерения широкого спектра химических и механических сигналов в адгезивных ячейках11,12.
iTACS состоит из двух компонентов: модуля сбора и обучения (AcTrM) и модуля анализа и визуализации (AnViM). AcTrM построен на μManager - приложении для сбора изображений на основе NIH-ImageJ - чтобы пользователи могли настраивать покадровые измерения традиционных оптических свойств и различных физических свойств адгезивных ячеек в нескольких образцах12. AcTrM облегчает обучение пользователей с помощью кратких указаний, включенных в графический интерфейс. Кроме того, он имеет новую функцию автофокусировки на основе эталонных изображений, которая предназначена для облегчения измерений физических сил в режиме реального времени и обеспечения качественной стандартизации полученных данных.
AnViM построен на плагинах ImageJ, ускоренном программном обеспечении и скриптах обработки файлов, которые позволяют пользователям количественно оценивать более 50 свойств, включая клеточную форму, размер, ориентацию, скорость и направление движения, тяги, оказываемые на внеклеточный матрикс (ECM), а также на соседние клетки, сократительные и сдвиговые моменты как отдельных адгезивных клеток, так и их соседней области. AnViM облегчает пользователям количественную оценку физических свойств клеток, не осваивая базовый технический фон11. Кроме того, он позволяет анализировать данные в интерактивном или пакетном режиме обработки. Он генерирует тепловые карты, показывающие пространственные вариации, и графики, показывающие временное изменение свойств отдельных клеток.
В типичном эксперименте пользователь культивирует клетки на эластическом гидрогеле с соответствующими белками внеклеточного матрикса на верхней поверхности и двумя типами встроенных флуоресцентных маркеров. По сути, изображения этих флуоресцентных маркеров до и после культивирования клеток достаточны для количественной оценки сил внутри и вокруг отдельных клеток2,13. AnViM сопоставляет эти результаты с отдельными ячейками адгезивного кластера и генерирует проницательные изображения и графики.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

Количественная оценка клеточных сил и движения значительно продвинулась за последние четыре десятилетия. Эти достижения обеспечили основу для изучения проницательных механических сигнальных процессов в системах клеточных культур. Тем не менее, область в настоящее время сталкивается с тремя проблемами: отсутствие качественной стандартизации полученных данных, технические ошибки в анализе и визуализации данных, и, возможно, самое главное, технология остается в значительной степени недоступной для обычных лабораторий клеточной биологии. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали новую экспериментальную платформу - Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS). iTACS состоит из двух компонентов: модуля сбора и обучения (AcTrM) и модуля анализа и визуализации (AnViM). AcTrM основан на μManager - программном обеспечении для управления микроскопом на основе NIH-ImageJ - и облегчает самообучение пользователей и автоматизацию общих протоколов получения изображений. AnViM основан на NIH-ImageJ и облегчает удобную автоматизацию анализа данных и проницательную визуализацию результатов. Эти эксперименты включают культивирование адгезивных клеток на гидрогелях, визуализацию фидуциальных маркеров, встроенных в гидрогель, и, наконец, извлечение из этих изображений всесторонней механической характеристики клеток. В настоящее время iTACS позволяет пользователю анализировать и отслеживать широкий спектр свойств, включая морфологию, движение, цитоскелетные силы и флуоресценцию отдельных клеток и их соседней области. Вопрос стандартизации качества был рассмотрен в AcTrM с помощью эталонного метода перефокусировки с визуальным контролем. Технические проблемы в анализе данных были решены в AnViM с помощью многосторонней процедуры сегментации изображений, удобного для пользователя подхода к определению граничных условий и новой визуализации данных на основе клеточных свойств. AcTrM предназначен для облегчения простого преобразования базовых флуоресцентных микроскопов в экспериментальные установки клеточной механики, а AnViM оснащен, чтобы позволить пользователям измерять клеточные механические сигналы, не требуя инженерного опыта. iTACS будет доступен исследовательскому сообществу в виде пакета с открытым исходным кодом с возможностями разработки, управляемыми сообществом.

Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

Платформа Integrative Toolkit to Analysis Cellular Signals (iTACS) автоматизирует процесс одновременного измерения широкого спектра химических и механических сигналов в адгезивных ячейках. iTACS предназначен для содействия развитию, ориентированного на сообщество, и позволяет исследователям использовать все функции платформы независимо от их образования.

Интегративный инструментарий для анализа клеточных сигналов: сил, движения, морфологии и флуоресценции

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Высокой пропускной метод глобально исследования морфологии органелл в CEREVISIAE С.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Анализ аутофагии в<em&gt; Пеницилл золотистый</em&gt; С помощью голодания колодки в сочетании с флуоресцентной микроскопии

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Реализация Patch зажим и жить флуоресцентной микроскопии для мониторинга функциональных свойств Свежевыделенные ДОК эпителия

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Локальное поле флуоресцентной микроскопией: Визуализация клеточных сигналов в интактных сердцах

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...