Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
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D.T.T. agradece al personal afiliado al Centro de Biología Pulmonar de la Universidad del Sur de Alabama por estimular las discusiones sobre las necesidades de investigación de biología celular experimental. Estas discusiones fueron cruciales para iniciar el desarrollo de iTACS.
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional de Salud / Instituto Nacional de Sangre Cardíaca Pulmonar, P01 HL66299 y R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Álvarez), F32-HL144040-01 (Xu), y de la Universidad del Sur de Alabama a través del Fondo de Investigación del Cáncer Abraham Mitchell (Singh, Palanki, Tambe), Beca de Investigación y Desarrollo Académico (Tambe), Honors College y Summer Undergraduate Research Fellow (Nguyen).

<ol>
	<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces.">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li><li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy.">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li><li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. 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Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Las células adherentes utilizan señales mecánicas y químicas para sobrevivir, crecer y funcionar. Una amplia variedad de software de microscopía optimiza la experiencia del usuario en la evaluación de las señales químicas a través de imágenes basadas en fluorescencia. Sin embargo, la evaluación de las señales mecánicas implica capacidades que no están disponibles en el software de microscopía estándar. Además, la evaluación de señales mecánicas es más eficiente cuando la adquisición de datos se integra con el análisis de datos. La falta de una plataforma unificada que satisfaga las necesidades únicas de la evaluación mecánica de señales ha sido una brecha tecnológica importante en la biología celular experimental. El Kit de herramientas integradoras para analizar señales celulares (iTACS) está diseñado para satisfacer esta brecha. Los dos componentes de iTACS, AnViM y AcTrM, equipan a los usuarios con las capacidades necesarias para cuantificar las propiedades celulares de cuatro grandes categorías: fuerzas, movimiento, morfología y fluorescencia / brillo. A través de estas categorías, iTACS es actualmente capaz de revelar más de 50 aspectos únicos de células adherentes individuales. Estos aspectos comprenden propiedades específicas de cada categoría amplia, incluyendo su valor representativo y variabilidad a través de la celda (Tabla suplementaria S1). Por ejemplo, dentro de las fuerzas, hay fuerzas de tracción a través del citoesqueleto, anisotropía de esta tensión, la orientación de la tensión máxima y tensión de corte a través de la interfaz célula-ECM que tiene una profunda influencia en el comportamiento de las células adherentes1,3,6.
Un enfoque novedoso para examinar el comportamiento mecánico de células individuales de una monocapa Las células individuales de una monocapa participan en un intercambio de señales de naturaleza química y mecánica3. Estos dos tipos de señales se transmiten a través de la monocapa celular de una manera diferente23. Sin embargo, el conocimiento de la transmisión de señales mecánicas va a la zaga del de la transmisión de señales químicas. Esta brecha de conocimiento coincide con una falta sostenida de enfoques simples e intuitivos para evaluar las señales mecánicas celulares. El novedoso enfoque de mapeo de datos descrito aquí está equipado para llenar este vacío. Dicho mapeo revela que la fluctuación de la tensión citoesquelética intrínseca en la región vecina de una célula sirve como señales de relajación, fluidización y anclaje que regulan los cambios en la forma, el tamaño y la velocidad celular de la célula18. Los mapas de las propiedades de las regiones vecinas exhiben patrones de "subdivisión multicelular" donde las células dentro de la subdivisión están expuestas a un microambiente relativamente uniforme y las células en el límite de la subdivisión están expuestas a un microambiente notablemente no uniforme18.
Accesibilidad de la tecnología de medición de fuerza Existe una variedad de protocolos para fabricar hidrogeles PAA, analizar la deformación del hidrogel y el movimiento celular, y cuantificar las fuerzas célula-ECM y célula-célula1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 ,28,29,30,31,32. Sin embargo, estos desarrollos permanecen fuera del alcance de los laboratorios comunes de biología celular y confinados a laboratorios con experiencia en ingeniería. Al automatizar los aspectos técnicos de estos enfoques e integrarlos bajo una plataforma unificada y fácil de usar, el objetivo de iTACS es hacer de la evaluación de señales mecánicas una actividad rutinaria en la investigación y educación en biología celular experimental.
ImageJ permite a los usuarios desarrollar aplicaciones utilizando enfoques que requerirían poca o ninguna capacitación11. iTACS se construye en gran medida utilizando enfoques de scripting simples para facilitar el desarrollo continuo impulsado por la comunidad. Una gran parte de AcTrM se programa utilizando scripts de BeanShell, y la mayor parte de AnViM se programa utilizando imageJ Macros. Estos scripts y la guía para implementar estas capacidades en el microscopio del usuario están disponibles a través de GitHub (<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>).
Estandarización de la calidad de las imágenes adquiridas Aunque las técnicas basadas en sustrato elástico para cuantificar las fuerzas físicas en las células adherentes se han desarrollado e implementado en varios laboratorios, el protocolo aún carece de estandarización. Un área que más necesita estandarización es la calidad de las imágenes de cuentas superiores adquiridas (Figura suplementaria S1). Problemas significativos surgen de la deriva en el enfoque a lo largo del experimento. Nuestro novedoso enfoque de reenfoque basado en imágenes de referencia hace que dicho enfoque sea un proceso objetivo. Los parámetros definidos en el primer paso de AcTrM imponen los límites de calidad objetivos necesarios. Otras medidas de estandarización pueden programarse en futuras versiones de AcTrM.
La amplia aplicabilidad de iTACS Además de cuantificar numerosos aspectos de las células adherentes, la estructura iTACS facilita su uso para diversos protocolos y necesidades experimentales. AcTrM permite la autoformación del usuario guiada por software. Las imágenes de alta velocidad requeridas, por ejemplo, por la evaluación simultánea de las fluctuaciones de calcio citoplasmático están actualmente limitadas por la velocidad del hardware de reposicionamiento y reenfoque y se realizan mejor en un lugar a la vez. Sin embargo, la implementación actual está bien equipada para imágenes a largo plazo, imágenes interrumpidas, donde la muestra no se puede retener en la etapa del microscopio durante toda la duración del experimento. Dado que las imágenes de referencia se adquieren al comienzo del experimento, iTACS permite la obtención de imágenes en tiempo real de señales mecánicas, abriendo nuevas vías en aplicaciones de detección de drogas. AnViM permite a los usuarios proporcionar información altamente técnica en términos sencillos. La capacidad de cuantificar un amplio espectro de propiedades celulares y rastrearlas a lo largo del experimento constituye capacidades críticas necesarias para descubrir nuevos mecanismos de comunicación intercelular.
Para el desarrollo futuro de iTACS, hemos identificado cuatro áreas de enfoque: (1) mejora de la adquisición de datos y la velocidad de análisis de datos, (2) implementación de enfoques para evaluar nuevas señales celulares13, (3) desarrollo de talleres y módulos educativos sobre evaluación de señales celulares basada en iTACS, (4) desarrollo de soluciones de automatización de bajo costo.

Las herramientas de análisis de datos e imágenes ópticas de uso común emplean tecnologías de hardware y software que son casi anticuadas. El retraso en la traducción e implementación de los avances en dispositivos electrónicos, enfoques computacionales y análisis matemático en herramientas comunes de biología celular experimental es una restricción importante en el ritmo de crecimiento en nuestro conocimiento de la fisiología celular. Actualmente, los investigadores de biología celular encuentran herramientas de biología molecular al alcance, pero herramientas basadas en principios de ingeniería están fuera de su alcance. Una de estas herramientas basadas en principios de ingeniería es la microscopía de esfuerzo monocapa (MSM)1,2. Si bien el MSM ha sido adaptado y estudiado en varios laboratorios de todo el mundo, su uso se limita principalmente a laboratorios con experiencia en ingeniería3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ es una de las herramientas de código abierto más populares entre los investigadores de biología celular10. Los avances impulsados por la contribución de la comunidad de usuarios han sido fundamentales para su popularidad11,12. ImageJ tiene características que permiten a los usuarios desarrollar aplicaciones con una combinación de un lenguaje de programación avanzado y enfoques de scripting simplificados. Estas características facilitan a los usuarios con conocimientos básicos de programación para implementar, adaptar y avanzar en cualquier nueva contribución al software. Sobre la base de estas cualidades de NIH-ImageJ, hemos desarrollado el Kit de herramientas integrativas para analizar señales celulares (iTACS), que permite una integración de bajo costo de las herramientas de hardware y software deseadas para automatizar la medición de una amplia variedad de señales químicas y mecánicas a través de células adherentes11,12.
iTACS consta de dos componentes: Módulo de Adquisición y Capacitación (AcTrM) y Módulo de Análisis y Visualización (AnViM). AcTrM se basa en μManager, una aplicación de adquisición de imágenes basada en NIH-ImageJ, para permitir a los usuarios configurar mediciones de lapso de tiempo de propiedades ópticas tradicionales y una variedad de propiedades físicas de células adherentes en múltiples muestras12. AcTrM facilita la formación del usuario a través de instrucciones concisas incluidas en la interfaz gráfica. Además, tiene una característica novedosa de enfoque automático basado en imágenes de referencia que está diseñado para facilitar las mediciones en tiempo real de las fuerzas físicas y permitir la estandarización de la calidad de los datos adquiridos.
AnViM se basa en complementos de ImageJ, software acelerado y scripts de manejo de archivos que permiten a los usuarios evaluar cuantitativamente más de 50 propiedades, incluida la forma celular, el tamaño, la orientación, la velocidad y la dirección del movimiento, las tracciones ejercidas sobre la matriz extracelular (ECM) y en las células vecinas, los momentos contráctiles y de cizallamiento de las células adherentes individuales y su región vecina. AnViM facilita a los usuarios cuantificar las propiedades físicas celulares sin dominar los antecedentes técnicos subyacentes11. Además, permite el análisis de datos en modo interactivo o de procesamiento por lotes. Genera mapas de calor que revelan la variación espacial y gráficos que muestran la variación temporal de las propiedades de las células individuales.
En un experimento típico, el usuario cultiva células en un hidrogel elástico con proteínas de matriz extracelular apropiadas en la superficie superior y dos tipos de marcadores fluorescentes incrustados. Esencialmente, las imágenes de estos marcadores fluorescentes antes y después del cultivo de las células son suficientes para cuantificar las fuerzas dentro y alrededor de las células individuales2,13. AnViM mapea estos resultados en celdas individuales del clúster adherente y genera imágenes y gráficos perspicaces.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

La evaluación cuantitativa de las fuerzas celulares y el movimiento avanzó considerablemente en las últimas cuatro décadas. Estos avances proporcionaron el marco para examinar los perspicaces procesos de señalización mecánica en los sistemas de cultivo celular. Sin embargo, el campo se enfrenta actualmente a tres problemas: la falta de estandarización de la calidad de los datos adquiridos, los errores técnicos en el análisis y la visualización de datos, y quizás lo más importante, la tecnología sigue estando en gran medida fuera del alcance de los laboratorios comunes de biología celular. Para superar estas limitaciones, desarrollamos una nueva plataforma experimental: Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS). iTACS consta de dos componentes: Módulo de Adquisición y Capacitación (AcTrM) y Módulo de Análisis y Visualización (AnViM). AcTrM se basa en μManager, un software de control de microscopio basado en NIH-ImageJ, y facilita el autoentrenamiento del usuario y la automatización de los protocolos comunes de adquisición de imágenes. AnViM se basa en NIH-ImageJ y facilita la automatización fácil de usar del análisis de datos y la visualización perspicaz de los resultados. Estos experimentos implican el cultivo de células adherentes en hidrogeles, la obtención de imágenes de marcadores fiduciarios incrustados en el hidrogel y, finalmente, la extracción de estas imágenes de una caracterización mecánica integral de las células. Actualmente, iTACS permite al usuario analizar y rastrear una amplia gama de propiedades, incluida la morfología, el movimiento, las fuerzas citoesqueléticas y la fluorescencia de células individuales y su región vecina. El problema de la estandarización de la calidad se abordó en AcTrM con una técnica de reenfoque guiada por imágenes de referencia. Los problemas técnicos en el análisis de datos se abordaron en AnViM con un procedimiento de segmentación de imágenes de múltiples frentes, un enfoque fácil de usar para identificar las condiciones de contorno y una nueva visualización de datos basada en propiedades celulares. AcTrM está diseñado para facilitar la transformación directa de microscopios de fluorescencia básicos en equipos experimentales de mecánica celular, y AnViM está equipado para permitir a los usuarios medir señales mecánicas celulares sin requerir una formación en ingeniería. iTACS estará disponible para la comunidad de investigación como una suite de código abierto con capacidades de desarrollo impulsadas por la comunidad.

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Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

La plataforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiza el proceso de medición simultánea de una amplia variedad de señales químicas y mecánicas en células adherentes. iTACS está diseñado para facilitar el desarrollo impulsado por la comunidad y permitir a los investigadores utilizar todas las características de la plataforma, independientemente de su formación académica.

Kit de herramientas integradoras para analizar señales celulares: fuerzas, movimiento, morfología y fluorescencia

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

Las células adherentes ejercen fuerzas sobre su entorno, y esas fuerzas incluyen las fuerzas que las células ejercen sobre el sustrato, que se muestra aquí en verde, y las fuerzas que las células ejercen sobre sus vecinas, que se muestran en rojo. Estas fuerzas se pueden medir en monocapas celulares utilizando una técnica llamada microscopía de estrés monocapa. Brevemente, la técnica consiste en preparar hidrogeles que contienen pequeñas cuentas fluorescentes, justo debajo de la superficie superior, y grandes cuentas fluorescentes que están pegadas al vidrio.En este hidrogel, uno ve las células y las cultiva para que confluyan o cualquier estado que uno desee para medir las fuerzas. La medición de las fuerzas requiere imágenes de la monocapa celular, tomando imágenes de luz transmitidas de las células e imágenes de luz fluorescente de las cuentas diminutas y grandes. Cada una de estas imágenes se adquieren en el mismo plano vocal.Estas imágenes se adquieren cuando las células se unen y se separan del hidrogel. Y una comparación de estos dos conjuntos de imágenes nos proporciona los datos necesarios para cuantificar todas estas fuerzas. Ahí es donde AcTrM y AnViM entran en juego.Después de colocar las celdas, para que pueda adquirir imágenes en la misma ubicación exacta, en cualquier instancia deseada, ese protocolo se programa en AcTrM y luego analizar estos datos y visualizar los resultados, ese es el propósito de AnViM. En los próximos minutos, lo guiaremos a través del proceso de adquisición de imágenes para una monocapa de células de confluencia. El paso cero de la acción solicita al usuario que seleccione el tipo de adquisición.Una nueva adquisición para comenzar un nuevo experimento, o una adquisición continua para reanudar un experimento anterior. Haga clic en Nueva adquisición para crear una lista de posiciones. El paso uno de la acción enumera todos los pasos siguientes.Y estas acciones se tomarán en la ventana de la lista de posiciones de etapa aquí. Haga clic en Live in Micro-Manager para visualizar la muestra para realizar ajustes manuales. En la vista en vivo, veremos la fase.Aquí está claro. Ahora, uno tendrá que mirar las cuentas. Aquí, las cuentas se pueden visualizar en fluorescencia.Así que seleccione el canal apropiado para las cuentas superiores. También es importante que pueda ver algunas cuentas inferiores, así que veamos un canal para las cuentas inferiores. Lo que ves aquí es una imagen borrosa de las cuentas inferiores, y eso está completamente bien siempre que puedas decir que las cuentas inferiores están allí, lo que puedes hacer en esta imagen.Lista de posiciones, haga clic en Marcar. Así es como se crea una lista de posiciones. Después de crear una lista de posiciones, que se discutió en el video anterior, siga los pasos enumerados en el paso de acción dos usando la ventana de adquisición multidimensional.Digamos que queremos realizar un largo lapso de tiempo. Aquí, voy a indicar el número de imágenes que queremos que se tomen. El primer canal va a ser el canal de fase.El siguiente va a ser de las cuentas superiores y el siguiente va a ser las cuentas inferiores. Haga clic en Cerrar en la ventana de adquisición multidimensional y haga clic en Aceptar en el paso dos de AcTrM. La salida se guardará en el directorio identificado en la ventana de adquisición multidimensional.El paso de acción tres preguntará si el experimento necesita recuperación. La respuesta suele ser sí. Aquí iTACS pregunta, ¿queremos realizar una recuperación refinada?Esta primera parte nos va a acercar bastante a una recuperación refinada, pero la parte inferior nos va a acercar aún más a una mayor precisión de reposicionamiento. Si la recuperación se va a realizar utilizando un campo de visión limitado, se ofrece esta opción, pero para este experimento, no seleccionaremos esa opción. En este punto, la adquisición de un conjunto de imágenes de referencia está completa y Micro-Manager se puede cerrar.Para la adquisición de imágenes, se iniciará AcTrM. Seleccione la ampliación y elija el directorio que contiene las carpetas de datos. Seleccione opciones para reposicionar la placa junto con el canal utilizado para el reposicionamiento.Se proporciona una interfaz para hacer coincidir lo que se ve actualmente en la cámara con las imágenes guardadas. Si hay superposición, las imágenes mostrarán un color rojo y verde junto con el negro, y se puede realizar un ajuste manual. De lo contrario, presione aceptar y la adquisición continuará.Ahora podemos comenzar FIJI. Seleccione la primera opción en el menú desplegable de MSM etiquetada como preprocesamiento. A continuación, seleccione la carpeta que contiene la carpeta tnimgs.A continuación, tendremos que definir qué canal corresponde a qué imagen. Para este ejemplo, el canal 0 es la imagen de luz transmitida, que es la imagen de contraste de fase de las celdas. La imagen de la cuenta inferior es el Canal 2, y la imagen de la cuenta superior es el Canal 1.Y luego, te pregunta dónde se cruzan las celdas y de qué lado de la imagen. En este caso, las celdas son una monocapa que avanza hacia el borde derecho por lo que anularemos la selección de Derecha, y continuaremos. Aquí, una pequeña región de cuentas superiores, ubicadas lejos de la monocapa, tienen el mismo propósito que las imágenes de cuentas inferiores que parecerían más escasas y más grandes que las que se muestran aquí.Ahora nos pregunta si queremos cambiar el brillo y el contraste para que las cuentas aparezcan de manera prominente. Así que ajustamos usando las barras deslizantes en el menú, y una vez que las cuentas aparecen prominentes, haga clic en Aceptar. Y ahora, haremos la corrección de posición. Si hay algún cambio, se deshará de él.Y una vez hecho esto, creará la carpeta de análisis. Dentro de la carpeta de análisis, creará la carpeta de posición, P0, y las elecciones que hicimos en los menús de preprocesamiento anteriores se almacenan en opciones de análisis, como qué bordes se cruzaron, el tamaño del píxel y qué imagen es contraste de fase y otros. En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione Deformación del gel MSM.Desde aquí, seleccionaremos la opción que sea adecuada para nuestra distribución de cuentas. Y a medida que se procesan los datos, puede ver que ha aparecido una nueva carpeta de desplazamiento en la carpeta de posición. Aquí será donde se almacenarán todos los archivos de salida.Esto indica que el análisis está completo. Vamos a ver cómo calcular las fuerzas que se ejercen a través de la unión célula-ECM y la unión célula-célula y también el citoesqueleto de las células individuales de la monocapa. Para eso, seleccione la tercera opción.Y uno va a elegir el directorio que contiene tnimgs y la carpeta de análisis, lo que significa que uno seleccionará el directorio de ejemplo en lugar de cualquiera de estos directorios. Presione seleccionar, y le preguntará, ¿cuál es el módulo de corte de este gel? El módulo de cizallamiento es 1250 y el espesor del hidrogel en este ejemplo es de 118 micras.El nivel de ruido previsto se proporciona aquí. Luego, hay un desplazamiento medio es la bandera cero, que no se verifica en este caso. Seleccione Aceptar y la implementación que calcula la tracción se ejecuta a través de una función de MATLAB, que es como se implementa en esta versión de AnViM.Ahora está listo para hacer el cálculo de las fuerzas célula-célula o citoesqueléticas. Y la primera pregunta que hay que hacerse es, ¿es confluente la monocapa? En este caso particular, tenemos una monocapa que avanza y no hay una región de celda en el lado derecho del marco.Así que la respuesta es que la monocapa no es confluente, así que vamos a decir que no. Ahora se nos pide que dibujemos un polígono alrededor del objeto no celular más grande. Seleccionamos los métodos adecuados para la segmentación.Aquí nos está pidiendo que indiquemos el color de las células en los métodos tres y cuatro, por lo que aquí las celdas son negras por lo que elegiremos el negro. La segmentación que se produce a partir de estos diferentes métodos termina con algunos agujeros en la monocapa celular y algunas regiones blancas en el área sin células. Aquí podemos elegir, rellenar los puntos automáticamente y golpear OK.So ahora todos los puntos se llenan en la monocapa y sin área celular.Y luego, calcularemos las tensiones mecánicas en la monocapa celular. Ya hemos realizado la primera parte donde segmentamos las células de la región sin células, por lo que comenzamos este paso con la segunda parte que es la segmentación de las células individuales y las imágenes. Uno va a seleccionar la segmentación para celdas individuales.Y aquí nos pide que elijamos el directorio de posiciones. Y hay algo más de información dada aquí para estos parámetros. Luego le pide que dibuje un polígono alrededor de la celda normal más pequeña.Entonces, lo que dibujas aquí se usa para calcular el área y va a estipular que cualquier cosa más pequeña que esto no se define como una celda. Y luego pide la célula más grande. Entonces dibujamos un polígono alrededor de la célula normal más grande, y luego pregunta, ¿cuál es más brillante?¿Es la interfaz célula-célula más brillante o los centros celulares son más brillantes? Entonces, en este caso, la interfaz celda-celda es más brillante, así que voy a seleccionar la interfaz celda-celda. Así que esto indica que el cálculo se ha completado.Comencemos seleccionando el mapa en las intensidades de las celdas. Primero, iTACS le pide al usuario que seleccione el directorio de posición, que también se conoce como la carpeta P0. Cuando haya terminado, haga clic en Seleccionar.Luego se le pregunta al usuario si quiere que iTACS detecte la división celular o cuantifique la fluorescencia celular. En este caso, no tenemos ninguna proteína fluorescente dentro de la célula, por lo que elegiremos detectar la división celular. La siguiente diapositiva permite al usuario definir el tamaño de la región vecina, este es un análisis único que AnViM realiza donde observa las propiedades de las celdas individuales, así como las propiedades de las celdas de la región vecina.Aquí, el usuario puede elegir el ancho de una región vecina de celdas. En este caso, definimos las regiones vecinas con 60 píxeles. La primera casilla de verificación pregunta si queremos que iTACS recopile propiedades de las celdas, sí lo hacemos, y esta casilla de verificación pregunta si queremos que iTACS recopile propiedades de los vecinos, sí, queremos que iTACS también lo haga.Debajo de estas casillas de verificación, iTACS proporciona más información sobre las casillas de verificación si el usuario desea obtener más detalles sobre cada casilla de verificación. Esto indica que el análisis está completo. Una vez más, iTACS le pide al usuario que seleccione el directorio de posición.Luego, el usuario tiene la opción de mapear datos de fuerza, crear imágenes de los datos de fuerza, mapear datos de velocidad y crear imágenes de los datos de velocidad. Es importante tener en cuenta que la creación de imágenes lleva tiempo, por lo que uno puede elegir hacerlo ahora o esperar para hacerlo más tarde. Es por eso que el usuario tiene la opción de seleccionar las opciones o no.Aquí, iTACS le pide al usuario que determine el tamaño de la región vecina nuevamente, y puede usar el mismo tamaño que determinó para mapear intensidades, que era de 60 píxeles, en nuestro caso. Y de nuevo, se le pide al usuario que recopile las propiedades de las celdas, así como de su región vecina. Esto indica que el análisis está completo.En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione datos de seguimiento de resultados. Primero, iTACS le pide al usuario que seleccione el directorio de posición, que también se conoce como la carpeta P0. Cuando haya terminado, haga clic en Seleccionar.Aquí, iTACS pregunta desde qué número de trama desea el usuario que iTACS comience a rastrear datos. Es bastante seguro comenzar a rastrear desde el fotograma número dos, porque la velocidad no se puede determinar para el fotograma número uno. Aquí, iTACS le pide al usuario que indique el número máximo de parcelas a llenar simultáneamente.Y esencialmente, esta es una forma de acelerar el seguimiento de datos. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar y las opciones para elegir variables durante el seguimiento se presentan de manera similar a las opciones para generar mapas de calor. Las propiedades comunes de interés se proporcionan en el cuadro de texto en la parte superior de la ventana.Pero si desea personalizar sus variables, simplemente necesita eliminar todo en el cuadro de texto y seleccionar las propiedades específicas que se enumeran a continuación. En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione gráfico de resultados. Después de eso, iTACS le pregunta al usuario si el usuario desea limitar el trazado a celdas con pista ininterrumpida.Si no desea limitar el trazado a pistas ininterrumpidas, haga clic en No.Pero si desea limitar el trazado a celdas con pistas ininterrumpidas, haga clic en Sí aquí iTACS pregunta cuántas variables desea que el usuario trace el programa. iTACS es capaz de trazar hasta tres variables, y en este caso, solo trazaremos dos variables para ver la relación entre esos factores. En el menú desplegable Microscopía de esfuerzo monocapa o MSM, seleccione imagen de resultados.Aquí está el directorio de posición y, cuando haya terminado, haga clic en Seleccionar. iTACS luego nos pide que elijamos el marco inicial. Aquí, seleccionamos el fotograma número dos.Las opciones para hacer mapas de calor se presentan de manera similar a las opciones para trazar pistas de tiempo de celdas individuales. Con eso, concluimos cómo hacer un mapa de calor. Aquí se representa el rastro de tiempo de la velocidad celular en la tensión citoesquelética para la célula número uno.Las propiedades se muestran en un eje vertical compartido y el eje horizontal indica el número de instancia de tiempo, donde los fotogramas se adquieren a intervalos de 15 minutos. La segunda salida es una serie de mapas de calor una hora después del experimento. Las propiedades que se muestran aquí incluyen el área de propagación, la orientación, la circularidad, la velocidad, la dirección del movimiento, la orientación de la tensión máxima, la tensión citoesquelética, las tracciones del sustrato y la anisotropía de tensión de las células individuales.Así que este es un vistazo a un conjunto de experimentos. Hay varias otras situaciones experimentales en las que AnViM y AcTrM pueden ayudar al usuario a realizar el experimento de manera reproducible y estos contactos se enumeran en el manuscrito. Algunas de las características clave de iTACS incluyen la automatización del protocolo experimental, el análisis automatizado de datos y no se requieren antecedentes de ingeniería.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

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