Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

D.T.T., Güney Alabama Üniversitesi Akciğer Biyolojisi Merkezi'ne bağlı personele deneysel hücre biyolojisi araştırma ihtiyaçlarıyla ilgili tartışmaları teşvik eden için teşekkür eder. Bu tartışmalar iTACS'in geliştirilmesinin başlatılmasında çok önemliydi.
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü/Ulusal Kalp Akciğer Kanı Enstitüsü, P01 HL66299 ve R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Alvarez), F32-HL144040-01 (Xu) ve Güney Alabama Üniversitesi'nden Abraham Mitchell Kanser Araştırma Fonu (Singh, Palanki, Tambe), Araştırma ve Akademik Gelişim Hibesi (Tambe), Honors College ve Yaz Lisans Araştırma Görevlisi (Nguyen).

<ol>
	<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PloS One. 8 (2), 55172 (2013).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanotransduction+pathway+regulates+collective+migration+of+epithelial+cells.">A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).</li><li>Vedula, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+epithelial+closure+over+non-adherent+environments.">Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments.</a> Nature Communications. 6, 6111 (2015).</li><li>Lamason, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+Sca4+reduces+vinculin-mediated+intercellular+tension+to+promote+spread.">Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread.</a> Cell. 167 (3), 670-683 (2016).</li><li>Sunyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Dong, L., Oberai, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+cellular+traction+in+three-dimensional+nonlinear+hyperelastic+matrices.">Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices.</a> Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).</li><li>Nier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalman+inversion+stress+microscopy.">Kalman inversion stress microscopy.</a> Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).</li><li>Serrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Monolayer+Stress+Microscopy.">Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy.</a> Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+Image+Analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 20 (2010).</li><li>Patel, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+shear:+Role+of+intercellular+traction+and+cellular+moments+in+collective+cell+migration.">Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+complaint+matrices+for+quantifying+cellular+contraction.">Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Patel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+in+a+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+monolayer.">Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).</li><li>K&#228;hler, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+results+of+the+4th+International+PIV+Challenge.">Main results of the 4th International PIV Challenge.</a> Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Alvarez-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-layer+elastographic+3-D+traction+force+microscopy.">Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 39315 (2017).</li><li>Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+traction+force+microscopy.">Holographic traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3038 (2018).</li><li>Janmey, P. A., Miller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanical+signaling+in+development+and+disease.">Mechanisms of mechanical signaling in development and disease.</a> Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).</li><li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method.">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Saez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+exerted+by+epithelial+cell+sheets.">Traction forces exerted by epithelial cell sheets.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).</li><li>Deforet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+velocity+mapping+of+migrating+cell+populations+(AVeMap).">Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap).</a> Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).</li><li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces.">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li><li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy.">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li><li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+forces+and+kinematics+during+collective+cell+migration.">Mapping forces and kinematics during collective cell migration.</a> Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).</li><li>Charrier, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+make+viscoelastic+polyacrylamide+gels+for+cell+culture+and+traction+force+microscopy.">A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy.</a> APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Yapışan hücreler hayatta kalmak, büyümek ve işlev görmek için hem mekanik hem de kimyasal sinyaller kullanır. Çok çeşitli mikroskopi yazılımı, floresan bazlı görüntüleme yoluyla kimyasal sinyalleri değerlendirmede kullanıcı deneyimini optimize eder. Bununla birlikte, mekanik sinyallerin değerlendirilmesi, standart mikroskopi yazılımında bulunmayan yetenekleri içerir. Ayrıca, veri toplama veri analizi ile entegre edildiğinde mekanik sinyallerin değerlendirilmesi en verimli olanıdır. Mekanik sinyal değerlendirmesinin benzersiz ihtiyaçlarını karşılayan birleşik bir platformun olmaması, deneysel hücre biyolojisinde önemli bir teknolojik boşluk olmuştur. Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS) bu boşluğu karşılamak için tasarlanmıştır. iTACS'in iki bileşeni olan AnViM ve AcTrM, kullanıcıları dört geniş kategorinin hücresel özelliklerini ölçmek için gerekli yeteneklerle donatır: kuvvetler, hareket, morfoloji ve floresan/parlaklık. Bu kategorilerde, iTACS şu anda bireysel yapışan hücrelerin 50'den fazla benzersiz yönünü ortaya çıkarabiliyor. Bu yönler, hücre genelinde temsili değerleri ve değişkenlikleri de dahil olmak üzere her geniş kategorinin belirli özelliklerini içerir (Tamamlayıcı Tablo S1). Örneğin, kuvvetler içinde, sitoskeleton boyunca çekme kuvvetleri, bu gerilimin anizotropisi, maksimum gerilimin yönelimi ve bağlı hücrelerin davranışı üzerinde derin bir etkiye sahip hücre-ECM arayüzünde kesme stresi vardır1,3,6.
Bir monolayerin bireysel hücrelerinin mekanik davranışını incelemek için yeni bir yaklaşım Bir monolayerin bireysel hücreleri, kimyasal ve mekanik nitelikteki sinyallerin değişimiyle uğraşır3. Bu iki tür sinyal hücresel monolayer boyunca farklı bir şekilde iletilir23. Bununla birlikte, mekanik sinyal iletim bilgisi kimyasal sinyal iletiminin gerisinde kalır. Bu bilgi boşluğu, hücresel mekanik sinyalleri değerlendirmek için sürekli basit ve sezgisel yaklaşım eksikliği ile çakışmaktadır. Burada açıklanan yeni veri eşleme yaklaşımı bu boşluğu dolduracak donanıma sahip. Bu tür bir haritalama, bir hücrenin komşu bölgesinde içsel sitoskeletal gerginliğin dalgalanmasının hücresel şekil, boyut ve hücrenin hızındaki değişiklikleri düzenleyen gevşeme, akışkanlaştırma ve bağlantı sinyalleri olarak hizmet ettiğini ortaya koymaktadır18. Komşu bölgelerin özelliklerinin haritaları, alt bölümdeki hücrelerin nispeten düzgün bir mikroçevreye maruz kaldığı ve alt bölümün sınırında bulunan hücrelerin dikkat çekici derecede biçimsiz bir mikroçevreye maruz kaldığı "çok hücreli alt bölüm" desenleri sergiler18.
Kuvvet ölçüm teknolojisinin erişilebilirliği PAA hidrojelleri yapmak, hidrojel deformasyonunu ve hücresel hareketi analiz etmek ve hücre-ECM ve hücre hücre kuvvetlerini ölçmek için çeşitli protokoller vardır1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 ,28,29,30,31,32. Ancak bu gelişmeler ortak hücre biyolojisi laboratuvarlarının ulaşamayacağı bir yerde kalmakla birlikte mühendislik uzmanlığına sahip laboratuvarlarla sınırlı kalmaktadır. Bu yaklaşımların teknik yönlerini otomatikleştirerek ve birleşik ve kullanıcı dostu bir platform altında entegre ederek, iTACS'ın amacı mekanik sinyallerin değerlendirilmesini deneysel hücre biyolojisi araştırma ve eğitiminde rutin bir faaliyet haline getirmektir.
ImageJ, kullanıcıların çok az eğitim gerektiren veya hiç eğitim gerektirmeyen yaklaşımları kullanarak uygulamalar geliştirmelerine izin verir11. iTACS, topluluk odaklı sürekli geliştirmeyi kolaylaştırmak için büyük ölçüde basit komut dosyası yaklaşımları kullanılarak oluşturulmuştur. AcTrM'nin büyük bir kısmı BeanShell komut dosyaları kullanılarak programlanır ve AnViM'in büyük bölümü ImageJ Makroları kullanılarak programlanır. Bu komut dosyaları ve bu yetenekleri kullanıcının mikroskobuna uygulamak için rehberlik GitHub (<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>) aracılığıyla kullanılabilir.
Elde edilen görüntülerin kalite standardizasyonu Yapışan hücrelerdeki fiziksel kuvvetleri ölçmek için elastik-substrat tabanlı teknikler çeşitli laboratuvarlarda geliştirilmiş ve uygulanmış olsa da, protokol hala standardizasyondan yoksundur. Standardizasyona en çok ihtiyaç duyan alanlardan biri, elde edilen üst boncuk görüntülerinin kalitesidir (Ek Şekil S1). Deney boyunca odaktaki sürüklenmeden önemli sorunlar ortaya çıkar. Yeni referans-imaj temelli yeniden odaklanma yaklaşımımız, böyle bir odaklanmayı objektif bir süreç haline getiriyor. ACTrM'nin ilk adımında tanımlanan parametreler gerekli objektif kalite sınırlarını uygular. Diğer standardizasyon önlemleri AcTrM'nin gelecekteki sürümlerinde programlanabilir.
iTACS'in geniş uygulanabilirliği Yapışan hücrelerin çok sayıda yönünü ölçmenin yanı sıra, iTACS yapısı çeşitli deneysel protokoller ve ihtiyaçlar için kullanımını kolaylaştırır. ACTrM, yazılım destekli kullanıcının kendi kendini eğitmesine izin verir. Örneğin, sitoplazmik kalsiyum dalgalanmalarının eşzamanlı olarak değerlendirilmesi gereken yüksek hızlı görüntüleme, şu anda donanımı yeniden konumlandırma ve yeniden odaklama hızı ile sınırlıdır ve en iyi şekilde aynı anda tek bir yerde yapılır. Bununla birlikte, mevcut uygulama, numunenin deney boyunca mikroskop aşamasında tutulamadığı uzun süreli görüntüleme, kesintiye uğramış görüntüleme için iyi bir donanıma sahiptir. Referans görüntüleri deneyin başında elde edildiğinden, iTACS mekanik sinyallerin gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlar ve uyuşturucu tarama uygulamalarında yeni yollar açar. AnViM, kullanıcıların layman açısından son derece teknik bilgiler sağlamalarını sağlar. Geniş bir hücresel özellik spektrumunu ölçme ve deney boyunca izleme yeteneği, yeni hücreler arası iletişim mekanizmalarını keşfetmek için gereken kritik yetenekleri oluşturmaktadır.
iTACS'in gelecekteki gelişimi için dört odak alanı belirledik: (1) veri toplama ve veri analizi hızının geliştirilmesi, (2) yeni hücresel sinyalleri değerlendirmek için yaklaşımların uygulanması13, (3) iTACS tabanlı hücresel sinyal değerlendirmesi üzerinde atölyelerin ve eğitim modüllerinin geliştirilmesi, (4) düşük maliyetli otomasyon çözümlerinin geliştirilmesi.

Yaygın olarak kullanılan optik görüntüleme ve veri analizi araçları, neredeyse eskimiş donanım ve yazılım teknolojilerini kullanmaktadır. Elektronik cihazlardaki ilerlemelerin, hesaplamalı yaklaşımların ve matematiksel analizin yaygın deneysel hücre biyolojisi araçlarına çevrilmesi ve uygulanmasındaki gecikme, hücresel fizyoloji bilgimizdeki büyüme hızı üzerinde önemli bir kısıtlamadır. Şu anda, hücre biyolojisi araştırmacıları ulaşılabilecek moleküler biyoloji araçları bulmaktadır, ancak mühendislik ilkelerine dayanan araçlar ulaşılamazdır. Bu tür mühendislik ilkelerine dayalı bir araç Monolayer Stres Mikroskopisi (MSM)1,2'dir. MSM dünya çapında çeşitli laboratuvarlarda uyarlanmış ve incelenmiş olsa da, kullanımı öncelikle mühendislik uzmanlığına sahip laboratuvarlarla sınırlıdır3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ, hücre biyolojisi araştırmacıları arasında en popüler açık kaynaklı araçlardan biridir10. Kullanıcı topluluğu katkı odaklı gelişmeler popülerliğinin merkezinde yer 11,12 olmuştur. ImageJ, kullanıcıların gelişmiş bir programlama dili ve basitleştirilmiş komut dosyası yaklaşımlarının bir karışımıyla uygulama geliştirmelerine izin veren özelliklere sahiptir. Bu özellikler, temel programlama bilgisine sahip kullanıcıların yazılıma yeni katkıları uygulamasını, uyarlamasını ve ilerletmesini kolaylaştırır. NIH-ImageJ'in bu niteliklerine dayanarak, çok çeşitli kimyasal ve mekanik sinyallerin yapışan hücreler arasında ölçümünü otomatikleştirmek için istenen donanım ve yazılım araçlarının düşük maliyetli entegrasyonunu sağlayan Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti'ni (iTACS) geliştirdik11,12.
iTACS iki bileşenden oluşur: Edinme ve Eğitim Modülü (ACTrM) ve Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM). ACTrM, kullanıcıların geleneksel optik özelliklerin zaman atlamalı ölçümlerini ve birden fazla numunedeki yapışık hücrelerin çeşitli fiziksel özelliklerini ayarlamalarını sağlamak için NIH-ImageJ tabanlı bir görüntü alma uygulaması olan μManager üzerine inşa edilir12. ACTrM, grafik arayüzde yer alan kısa yol tarifleri aracılığıyla kullanıcı eğitimini kolaylaştırır. Buna ek olarak, fiziksel kuvvetlerin gerçek zamanlı ölçümlerini kolaylaştırmak ve elde edilen verilerin kalite standardizasyonunu sağlamak için tasarlanmış referans görüntü tabanlı otomatik odaklamanın yeni bir özelliğine sahiptir.
AnViM, kullanıcıların hücresel şekil, boyut, oryantasyon, hız ve hareket yönü, hücre dışı matris (ECM) üzerinde uygulanan çekişler ve komşu hücreler, hem bireysel bağlı hücrelerin hem de komşu bölgelerinin sözleşme ve kesme anları dahil olmak üzere 50'den fazla özelliği nicel olarak değerlendirmelerini sağlayan ImageJ eklentileri, hızlandırılmış yazılım ve dosya işleme komut dosyaları üzerine inşa edilmiştir. AnViM, kullanıcıların temel teknik arka plana hakim olmadan hücresel fiziksel özellikleri ölçmelerini kolaylaştırır11. Ayrıca, etkileşimli veya toplu işleme modunda veri analizi sağlar. Mekansal varyasyonu ortaya çıkaran ısı haritaları ve tek tek hücrelerin özelliklerinin zamansal varyasyonlarını gösteren grafikler üretir.
Tipik bir deneyde, kullanıcı, üst yüzeyde uygun hücre dışı matris proteinleri ve iki tür gömülü floresan belirteçleri ile elastik bir hidrojel üzerindeki hücreleri kültürler. Esasen, hücreleri kültlemeden önce ve sonra bu floresan belirteçlerin görüntüleri, bireysel hücrelerin içindeki ve etrafındaki kuvvetleri ölçmek için yeterlidir2,13. AnViM, bu sonuçları bağlı kümenin tek tek hücrelerine eşler ve içgörülü görüntüler ve grafikler oluşturur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

Hücresel kuvvetlerin ve hareketin nicel değerlendirmesi son 40 yılda önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu gelişmeler, hücre kültürü sistemlerindeki içgörülü mekanik sinyalizasyon süreçlerini incelemek için çerçeve sağladı. Bununla birlikte, alan şu anda üç sorunla karşı karşıyadır: elde edilen verilerin kalite standardizasyonunun olmaması, veri analizi ve görselleştirmede teknik hatalar ve belki de en önemlisi, teknoloji yaygın hücre biyolojisi laboratuvarları için büyük ölçüde ulaşılamaz durumdadır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni bir deneysel platform geliştirdik - Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS). iTACS iki bileşenden oluşur: Edinme ve Eğitim Modülü (ACTrM) ve Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM). ACTrM, NIH-ImageJ tabanlı bir mikroskop kontrol yazılımı olan μManager'ı temel alıyor ve ortak görüntü alma protokollerinin kullanıcı tarafından kendi kendine eğitilmesini ve otomasyonunun kolaylaştırılmasını kolaylaştırıyor. AnViM, NIH-ImageJ'ye dayanır ve veri analizinin kullanıcı dostu otomasyonunu ve sonuçların içgörülü görselleştirilmesini kolaylaştırır. Bu deneyler, hidrojeller üzerindeki yapışan hücrelerin kültleştirilmesini, hidrojel içine gömülü fidüsyal belirteçlerin görüntülenmesini ve son olarak bu görüntülerden hücrelerin kapsamlı bir mekanik karakterizasyonunun çıkarılmasını içerir. Şu anda, iTACS kullanıcının morfoloji, hareket, sitoskeletal kuvvetler ve tek tek hücrelerin ve komşu bölgelerinin floresanını içeren çok çeşitli özellikleri analiz etmesini ve izlemesini sağlar. Kalite standardizasyonu sorunu, referans görüntü destekli yeniden odaklama tekniği olan ACTrM'de ele alındı. Veri analizindeki teknik sorunlar, anvim'de çok uçlu görüntü segmentasyon prosedürü, sınır koşullarını tanımlamak için kullanıcı dostu bir yaklaşım ve yeni bir hücresel özellik tabanlı veri görselleştirmesi ile ele alındı. ACTrM, temel floresan mikroskopların deneysel hücre mekaniği makinelerine basit dönüşümlerini kolaylaştırmak için tasarlanmıştır ve AnViM, kullanıcıların mühendislik arka planı gerektirmeden hücresel mekanik sinyalleri ölçmelerini sağlamak için donatılmıştır. iTACS, topluluk odaklı geliştirme özelliklerine sahip açık kaynaklı bir paket olarak araştırma topluluğuna sunulacaktır.

Burada gösterilen örnek için iki önemli çıktı sunuyoruz. İlk çıktı, hücresel hız ve 1 numaralı hücre için sitoskeletal gerilimin zaman izidir (Şekil 16). Özellikler arasındaki görsel ilişkiyi kolaylaştırmak için özellikler paylaşılan bir dikey eksende gösterilir ve yatay eksen zaman örneği numarasını gösterir. Bu deneyde, 15 dakikalık bir aralıkta ardışık çerçeveler elde edildi. İkinci çıkış, deneye 1 saat boyunca bir dizi ısı haritasıdır (Şekil 17). Burada gösterilen özellikler yayılma alanı, oryantasyon, dairesellik, hız, hareket yönü, maksimum gerilim yönelimi, sitoskeletal gerilim, substrat çekişleri ve bireysel hücrelerin gerilim anizotropisini içerir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig01.jpg"> Şekil 1: Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Setinin Yapısı (iTACS). iTACS'in iki temel bileşeni Edinme ve Eğitim Modülü (ACTrM) ve Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM). ACTrM, mikroskop aşamasında sıkıca tutulabilen hidrojelleri hazırlamak için şu anda mevcut olan çeşitli hidrojel hazırlama tekniklerini, herhangi bir hücre tohumlamasını ve hücreleri bir odak düzleminde tutan bir büyüme protokolünü kullanabilir. AnViM, hidrojel ve monolayer deformasyonunu, hücre-ECM kuvvetlerini ve hücre-hücre kuvvetlerini ölçmek için çeşitli teknikler kullanabilir. Kuvvet ölçümleri protokolünün kullanıcı tarafından tercih edilen tüm bileşenleri iTACS'de barındırılabilir ve kesikli kutularla tanımlanmıştır. Katı kutularla tanımlanan bileşenler hücresel kuvvet ölçüm teknolojisine yeni katkılardır. AnViM'deki görselleştirme, özelliklerin tek tek hücreler arasında ortanca değerine ve değişkenliğine odaklanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig02.jpg"> Şekil 2: Referans görüntü alımı - bölüm 1. AcTrM kullanarak konum listesi oluşturma adımları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig03.jpg"> Şekil 3: Referans görüntü alımı - bölüm 2. AcTrM kullanarak başvuru görüntüleri edinme adımları. Adım 2, 4 ve 6'nın ayrıntılı görünümleri sırasıyla Ek Rakamlar S2, S3 ve S4'te sunulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig04.jpg"> Şekil 4: Kalan deney için otomatik görüntü alımı. AcTrM kullanarak hücresel davranışı değerlendirmek için görüntü almaya devam etme adımları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig05.jpg"> Şekil 5: Otomatik veri analizinin ayarlanması. AnViM kullanarak otomatik görüntü analizine başlama adımları. Yazılım, AcTrM tarafından kullanılan görüntü biçimini tanır. 3. ve 5. basamaklardaki panellerin ayrıntılı bir görünümü sırasıyla Ek Şekil S5 ve Tamamlayıcı Şekil S6'da sunulmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig06.jpg"> Şekil 6: Hidrojel ve monolayer deformasyonunun nicelleştirilmesi - bölüm 1. Hidrojel üst yüzeyinin deformasyonunu ölçmek için Tseng, Q. ve ark., PNAS (2012)20'nin Parçacık Görüntü Velosimetrisi uygulaması olan AnViM aracılığıyla devreye girme adımları. Kullanıcılar ayrıca AnViM içinde hidrojel deformasyonunu ölçmek için diğer yaklaşımları da uygulayabilirler. Ek Şekil S7'de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig07.jpg"> Şekil 7: Hidrojel ve monolayer deformasyonunun nicelleştirilmesi - bölüm 2. Tek tek hücrelerin yerel hareketini ölçmek için Tseng, Q. ve ark., PNAS (2012)20'nin Parçacık Görüntü Velosimetrisi uygulaması, AnViM aracılığıyla devreye girme adımları. Kullanıcılar ayrıca hücresel hareketi ölçmek için AnViM içinde diğer yaklaşımları da uygulayabilirler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig08.jpg"> Şekil 8: Hücre-ECM ve hücre-hücre kuvvetlerinin nicelemesi. AnViM aracılığıyla , Trepat ve ark.'ın Fourier Transform Traction Mikroskopisi uygulaması, hidrojel üzerindeki hücreler tarafından uygulanan kuvvetleri ölçmek için Doğa Fiziği (2009)15 ve tüm hücreler içindeki ve komşu hücreler arasındaki kuvvetleri ölçmek için Tambe ve ark., Nature Materials (2011)1 Monolayer Stres Mikroskopisi uygulamasını gerçekleştirmek için adımlar. Kullanıcılar ayrıca AnViM içinde hücre-ECM ve hücre hücre kuvvetlerini ölçmek için diğer yaklaşımları uygulayabilir. Ek Şekil S8 ve Tamamlayıcı Şekil S9'da 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig09.jpg"> Şekil 9: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme - bölüm 1. Yeni bir çok uçlu yaklaşım kullanarak hücreleri içeren görüntü bölgelerini segmentlere ayıracak adımlar. Bu yaklaşım, hücrelerin faz kontrastını, parlak alanı veya floresan görüntülerini segmentlere ayırabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig10.jpg"> Şekil 10: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme - bölüm 2. AnViM'de geliştirilen yeni çok uçlu bir yaklaşım kullanarak tek katmanlı bir hücreyi tek tek segmentlere ayıracak adımlar. Bu yaklaşım, hücrelerin faz kontrastını, parlak alanı veya floresan görüntülerini segmentlere ayırabilir. Ek Şekil S10'da 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig11.jpg"> Şekil 11: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme - bölüm 3. AnViM kullanarak tek tek hücreler içinde ve tek tek hücrelerin komşu bölgesinde bölgedeki piksel yoğunluklarını değerlendirme adımları. Değerlendirilen yoğunluklar arasında iletilen ışık yoğunluğu ve floresan yoğunluğu yer almaktadır. Bu bölüm, tek tek hücreler içinde ve tek tek hücrelerin komşu bir bölgesinde piksel yoğunluklarının ortanca değerini ve standart sapması eşler. Ek Şekil S11'de adım 2'nin ayrıntılı bir görünümü sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig12.jpg"> Şekil 12: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme - bölüm 4. AnViM kullanarak tek tek hücreler içinde ve tek tek hücrelerin komşu bölgesinde ızgara noktalarının kuvvetlerini ve hareket özelliklerini değerlendirme adımları. Bu bölüm, tek tek hücreler içindeki ve tek tek hücrelerin komşu bir bölgesindeki özelliklerin ortanca değerini ve standart sapmasıyla eşler. 2. ve 3. adımların ayrıntılı görünümü Ek Şekil S12 ve Tamamlayıcı Şekil S13'te sunulmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig12large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig13.jpg"> Şekil 13: Sonuçların görselleştirilmesi - bölüm 1. AnViM kullanarak denemenin tüm süresi boyunca tek tek hücrelerin özelliklerini izleme adımları. 2. ve 3. adımların ayrıntılı görünümü Ek Şekil S14 ve Tamamlayıcı Şekil S15'te sunulmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig13large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig14.jpg"> Şekil 14: Sonuçların görselleştirilmesi - bölüm 2. AnViM kullanarak değerlendirilen özelliklerin zaman izlemelerini oluşturma adımları. Kullanıcı, bir grafikte en fazla üç özellik çizme seçeneğine sahiptir. Zaman izlemeleri, tüm hücreler veya yalnızca izlemenin tüm deneme boyunca başarılı olduğu hücreler için oluşturulur. Ek Şekil S16 ve Tamamlayıcı Şekil S17'de 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig14large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig15.jpg"> Şekil 15: Sonuçların görselleştirilmesi - bölüm 3. AnViM kullanarak değerlendirilen özelliklerin ısı haritalarını oluşturma adımları. Isı haritaları, başlangıç karesini izleyen tüm kareler ve seçilen tüm özellikler için oluşturulur. Adım 3'ün ayrıntılı bir görünümü ek Şekil S18'de sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig15large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig16.jpg"> Şekil 16: Hücre kimliği 1 için zaman izlemeleri. Görüntülenen iki özellik hücresel sitoskeletal gerilim ("avgtenMedian") ve hücresel hız ("speedMedian"). Hem hücresel sitoskeletal gerilim hem de hücresel hız, hücrelerin içindeki ızgara noktaları boyunca ortanca değer olarak ölçülür. İki özellik, değerlendirilen özellikler arasındaki ilişkileri görselleştirmek için rasgele birimlerle aynı eksende çizilir. Ek değişken adları Tamamlayıcı Tablo S1'de listelenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig16large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig17.jpg"> Şekil 17: Analiz edilen monolayer boyunca tek tek hücrelerin özelliklerinin ısı haritaları. Her hücre, panelde belirtilen özelliğin ortanca değeriyle renklendirilir. Bu nedenle, koyu kırmızı renk spektrumundaki maksimum hücresel değeri, koyu mavi ise analiz edilen monolayer genelinde minimum hücresel değeri gösterir. Tambe ve ark., PLoS One (2013)2'de açıklandığı gibi, sınıra daha yakın bulunan hücreler, görüntünün dışındaki hücrelerin bilinmeyen özelliklerinden etkilenen mekanik kuvvetlere sahiptir. Bu nedenle ısı haritası sınırdan uzak hücreler için oluşturulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig17large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Şekil S1: Üst ve alt floresan boncuk örnek görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s1.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S2: Şekil 3'ten 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s2.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S3: Şekil 3'ten 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s3.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S4 A: Şekil 3'ten 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s4.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S5: Şekil 5'ten 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s5.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S6: Şekil 5'ten 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s6.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S7: Şekil 6'dan 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s7.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S8: Şekil 8'den 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s8.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S9: Şekil 8'den 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s9.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S10: Şekil 10'dan 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s10.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S11: Şekil 11'den 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s11.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S12: Şekil 12'den 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s12.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S13: Şekil 12'den 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s13.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S14: Şekil 13'teki 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s14.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S15: Şekil 13'ten 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s15.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S16: Şekil 14'ten 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s16.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S17: Şekil 14'ten 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s17.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Şekil S18: Şekil 15'ten 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s18.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo S1: iTACS tarafından ölçülen seçili özelliklerin listesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS) platformu, bağlı hücrelerdeki çok çeşitli kimyasal ve mekanik sinyalleri aynı anda ölçme işlemini otomatikleştirir. iTACS, topluluk odaklı gelişimi kolaylaştırmak ve araştırmacıların eğitim geçmişlerine bakılmaksızın tüm platform özelliklerini kullanmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti: Kuvvetler, Hareket, Morfoloji ve Floresan

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

Yapışan hücreler çevrelerine kuvvet uygularlar ve bu kuvvetler, hücrelerin burada yeşil renkte gösterilen alt tabakaya uyguladıkları kuvvetleri ve hücrelerin komşularına uyguladığı kuvvetleri kırmızı renkte gösterir. Bu kuvvetler hücresel monolayerlerde monolayer stres mikroskopisi adı verilen bir teknik kullanılarak ölçülebilir. Kısaca, teknik, üst yüzeyin hemen altında küçük floresan boncuklar içeren hidrojellerin ve cama yapıştırılan büyük floresan boncukların hazırlanmasını içerir.Bu hidrojel üzerinde, kişi hücreleri görür ve onları bir araya getirmek için kültürler ya da kuvvetleri ölçmek için arzulanan durum. Kuvvetlerin ölçümü, hücresel monolayerin görüntülenmesini, hücrelerin iletilen ışık görüntülerinin ve küçük ve büyük boncukların floresan ışık görüntülerinin yapılmasını gerektirir. Bu görüntülerin her biri aynı ses düzleminde elde edilir.Bu görüntüler, hücreler hidrojelden bağlanıp ayrıldığında elde edilir. Ve bu iki görüntü kümesinin karşılaştırılması bize tüm bu güçleri ölçmek için gerekli verileri sağlar. İşte bu noktada AcTrM ve AnViM devreye giriyor.Hücreleri plakalayıp, görüntüleri aynı konumda, istediğiniz herhangi bir örnekte elde etmek için, bu protokol AcTrM'ye programlanır ve daha sonra bu verileri analiz etmek ve sonuçları görselleştirmek için AnViM'in amacı budur. Önümüzdeki birkaç dakika içinde, bir izdiham hücresi monolayer için görüntü edinme sürecinde size yol gösterecektir. Eylem adım sıfır kullanıcıdan alım türünü seçmesini ister.Yeni bir deney başlatmak için yeni bir satın alma veya daha önceki bir deneye devam etmek için sürekli bir satın alma. Pozisyon listesi oluşturmak için Yeni Edinme'yi tıklatın. Birinci eylem adımı, sonraki adımınızın tümlerini listeler.Ve bu işlemler buradaki sahne pozisyonu listesi penceresinde yapılacaktır. Örneği el ile ayarlamalar için görselleştirmek üzere Mikro Yönetici'de Canlı'yı tıklatın. Canlı görüntüde, aşamaya bakacağız.Burası çok açık. Şimdi, boncuklara bakmak gerekecek. Burada boncuklar floresan olarak görselleştirilebilir.Bu yüzden üst boncuklar için uygun kanalı seçin. Birkaç alt boncuk görebilmeniz de önemlidir, bu yüzden alt boncuklar için bir kanala bakalım. Burada gördüğünüz şey alt boncukların bulanık bir görüntüsüdür ve bu görüntüde gördüğünüz gibi, alt boncukların orada olduğunu söyleyebilirsiniz.Konum listesi, İşaretle'yi tıklatın. Pozisyon listesini bu şekilde oluşturursunuz. Önceki videoda açıklanan bir pozisyon listesi oluşturduktan sonra, çok boyutlu edinme penceresini kullanarak ikinci adımda listelenen adımları izleyin.Diyelim ki uzun bir zaman atlamalı performans sergilemek istiyoruz. Burada, çekmek istediğimiz görüntü sayısını belirteceğim. İlk kanal faz kanalı olacak.Bir sonraki en üst boncuklardan olacak ve ondan sonraki de alt boncuklar olacak. Çok boyutlu edinme penceresinde kapat'ı tıklatın ve AcTrM ikinci adımda Tamam'ı tıklatın. Çıktı, çok boyutlu alma penceresinde tanımlanan dizine kaydedilir.Üçüncü eylem, denemenin kurtarılması gerekip gerekmeyeceğini soracaktır. Cevap genellikle evet olacaktır. Burada iTACS soruyor, rafine bir kurtarma gerçekleştirmek istiyor muyuz?Bu ilk bölüm bizi rafine bir iyileşmeye oldukça yaklaştırır, ancak alt kısım bizi daha yüksek bir yeniden konumlandırma doğruluğuna daha da yaklaştırır. Kurtarma sınırlı bir görüş alanı kullanılarak yapılacaksa, bu seçenek sunulur, ancak bu deneme için bu seçeneği seçmeyeceğiz. Bu noktada, bir dizi referans görüntüsü elde edilmesi tamamlanır ve Micro-Manager kapatılabilir.Görüntü alımı için AcTrM başlayacaktır. Büyütmeyi seçin ve veri klasörlerini içeren dizini seçin. Plakayı yeniden konumlandırmak için kullanılan kanalla birlikte seçenekleri belirleyin.Şu anda kamerada görülenleri kaydedilen görüntülerle eşleştirmek için bir arayüz sağlanır. Çakışma varsa, görüntüler siyahla birlikte kırmızı ve yeşil bir renk görüntüler ve manuel ayarlama yapılabilir. Aksi takdirde, kabul et tuşuna bas ve edinme devam eder.Artık FIJI'yi başlatabiliriz. MSM açılır menüsünde ön işleme etiketli ilk seçeneği belirleyin. Ardından, tnimgs klasörünü içeren klasörü seçin.Daha sonra, hangi kanalın hangi görüntüye karşılık geldiğini tanımlamamız gerekecek. Bu örnekte, Kanal 0, hücrelerin faz kontrast görüntüsü olan iletilen ışık görüntüsüdür. Alt boncuk görüntüsü Kanal 2, üst boncuk görüntüsü ise Kanal 1'dir.Ve sonra, size hücrelerin nereden geçtiğini ve görüntünün hangi tarafını sorduğunuzdur. Bu durumda, hücreler sağ kenara doğru ilerleyen bir monolayerdir, bu yüzden Sağ'ın seçimini kaldıracağız ve devam edeceğiz. Burada, monolayerden uzakta bulunan üst boncukların küçük bir bölgesi, burada gösterilenlerden daha seyrek ve daha büyük görünecek alt boncuk görüntüleriyle aynı amaca hizmet eder.Şimdi bize boncukların belirgin bir şekilde görünmesi için parlaklığı ve kontrastı değiştirmek isteyip istemediğimizi soruyor. Bu nedenle, menüdeki kaydırıcı çubuklarını kullanarak ayarlıyoruz ve boncuklar belirgin göründüğünde Tamam'ı tıklayın. Ve şimdi, pozisyon düzeltme yapacağız. Herhangi bir kayma olursa, ondan kurtulacaktır.Ve yapıldıktan sonra, analiz klasörünü oluşturacaktır. Analiz klasörünün içinde, konum klasörünü oluşturacak, P0 ve önceki ön işleme menülerinde yaptığımız seçimler, hangi kenarların çaprazlandığı, piksel boyutu ve hangi görüntünün faz kontrastı olduğu ve diğerleri gibi analiz seçimlerinde saklanır. Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde MSM jel deformasyonu'nun öğesini seçin.Buradan boncuk dağıtımımıza uygun seçeneği seçeceğiz. Ve veriler işlendikçe, konum klasöründe yeni bir yer değiştirme klasörünün göründüğünü görebilirsiniz. Burası tüm çıktı dosyalarının depolanacağı yer olacaktır.Bu, analizin tamamlandığını gösterir. Hücre-ECM kavşağı ve hücre-hücre birleşimleri boyunca uygulanan kuvvetlerin ve ayrıca monolayerin tek tek hücrelerinin sitoskeletonunun nasıl hesaplanacağına bakacağız. Bunun için üçüncü seçeneği belirleyin.Ve biri tnimgs ve analiz klasörünü içeren dizini seçecek, bu da bu dizinlerden herhangi biri yerine örnek dizini seçeceği anlamına geliyor. Seç tuşuna bastığınızda, size bu jelin kesme modülü nedir? Kesme modülü 1250 ve bu örnekteki hidrojel kalınlığı 118 mikrondur.Beklenen gürültü seviyesi burada sağlanmaktadır. Daha sonra, bu durumda denetlenmeyen, yer değiştirme sıfır bayrağıdır. Tamam'ı seçin ve çekişi hesaplayan uygulama, AnViM'in bu sürümünde nasıl uygulandığını gösteren bir MATLAB işlevi aracılığıyla yürütülür.Şimdi hücre-hücre veya sitoskeletal kuvvetler için hesaplama yapmaya hazırdır. Ve sorulması gereken ilk soru, monolayer bir arada mı? Bu özel durumda, ilerleyen bir monolayerimiz var ve çerçevenin sağ tarafında hücre bölgesi yok.Yani cevap, monolayer'ın bir arada olmadığıdır, bu yüzden hayır diyeceğiz. Şimdi en büyük hücre dışı nesnenin etrafına bir çokgen çizmemiz isteniyor. Segmentasyon için uygun yöntemleri seçiyoruz.Burada üç ve dördüncü yöntemlerde hücrelerin rengini belirtmemizi istiyor, bu yüzden burada hücreler siyah, bu yüzden siyahı seçeceğiz. Bu farklı yöntemlerden üretilen segmentasyon, hücre monolayerinde bazı delikler ve hücre olmayan bölgede bazı beyaz bölgelerle sona erer. Burada seçebilir, noktaları otomatik olarak doldurabilir ve OK.So vurabiliriz, şimdi tüm noktalar monolayerde doldurulur ve hücre alanı yoktur.Ve sonra, hücresel monolayerdeki mekanik gerilimleri hesaplayacağız. Hücreleri hücresiz bölgeden ayırdığımız birinci bölümü zaten gerçekleştirdik, bu yüzden bu adıma tek tek hücrelerin ve görüntülerin segmentasyonu olan ikinci bölümle başlıyoruz. Biri tek tek hücreler için segmentasyon seçecek.Ve burada bizden pozisyon dizinini seçmemizi istiyor. Ve bu parametreler için burada daha fazla bilgi verilmiştir. Daha sonra en küçük normal hücrenin etrafına bir çokgen çizmenizi ister.Yani buraya çizdiğiniz şey alanı hesaplamak için kullanılır ve bundan daha küçük bir şeyin hücre olarak tanımlanmamasını şart koşardı. Ve sonra en büyük hücreyi istiyor. Sonra en büyük normal hücrenin etrafına bir poligon çiziyoruz ve sonra soruyor, hangisi daha parlak?Hücre hücresi arabirimi daha mı parlak yoksa hücre merkezleri daha mı parlak? Bu durumda, hücre-hücre arayüzü daha parlak, bu yüzden hücre-hücre arayüzünü seçeceğim. Yani bu hesaplamanın tamamlandığını gösterir.Hücre yoğunluklarında haritayı seçerek başlayalım. İlk olarak, iTACS kullanıcıdan P0 klasörü olarak da bilinen konum dizinini seçmesini ister. İşiniz bittiğinde Seç'i tıklatın.Daha sonra kullanıcıya iTACS'in hücre bölünmesini algılamasını veya hücresel floresan miktarını ölçmesini isteyip istemediği sorulur. Bu durumda, hücre içinde floresan proteinimiz yok, bu yüzden hücre bölünmesini tespit etmeyi seçeceğiz. Bir sonraki slayt, kullanıcının komşu bölgenin boyutunu tanımlamasını sağlar, bu, AnViM'in tek tek hücrelerin özelliklerine ve komşu bölgenin özelliklerine baktığında gerçekleştirdiği benzersiz bir analizdir.Burada, kullanıcı komşu bölgeye sahip bir hücrenin genişliğini seçebilir. Bu durumda, komşu bölgeleri 60 piksel ile tanımlıyoruz. İlk onay kutusu, iTACS'in hücrelerin özelliklerini toplamasını isteyip istemediğimizi sorar, evet iste, ve bu onay kutusu iTACS'in komşuların özelliklerini toplamasını isteyip istemediğimizi sorar, evet, iTACS'in de bunu yapmasını istiyoruz.Bu onay kutularının altında, kullanıcı her onay kutusu hakkında daha fazla ayrıntı istiyorsa, iTACS onay kutuları hakkında daha fazla bilgi sağlar. Bu, analizin tamamlandığını gösterir. Yine, iTACS kullanıcıdan konum dizinini seçmesini ister.Daha sonra, kullanıcıya kuvvet verilerini eşleme, kuvvet verilerinin görüntülerini oluşturma, hız verilerini eşleme ve hız verilerinin görüntülerini oluşturma seçeneği verilir. Görüntü oluşturmanın zaman aldığını unutmayın, bu nedenle şimdi yapmayı seçebilir veya daha sonra yapmayı bekleyebilirsiniz. Bu nedenle kullanıcıya seçenekleri seçme veya seçmeme seçeneği sunular.Burada, iTACS kullanıcıdan komşu bölgenin boyutunu yeniden belirlemesini ister ve bizim durumumuzda 60 piksel olan yoğunlukları eşlemek için belirlediğiniz boyutu kullanabilirsiniz. Ve yine, kullanıcıdan hücrelerin ve komşu bölgesinin özelliklerini toplaması istenir. Bu, analizin tamamlandığını gösterir.Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde, sonuçları izleme verilerini seçin. İlk olarak, iTACS kullanıcıdan P0 klasörü olarak da bilinen konum dizinini seçmesini ister. İşiniz bittiğinde Seç'i tıklatın.Burada, iTACS, kullanıcının iTACS'in verileri izlemeye hangi kare numarasından başlamasını istediğini sorar. İki numaralı kareden izlemeye başlamak oldukça güvenlidir, çünkü hız bir numaralı kare için belirlenemez. Burada, iTACS kullanıcıdan aynı anda doldurulacak maksimum çizim sayısını belirtini ister.Ve esasen, bu veri izlemeyi hızlandırmanın bir yoludur. İşiniz bittiğinde Tamam'ı tıklatın ve izleme sırasında değişkenleri seçme seçenekleri, ısı haritaları oluşturma seçeneklerine benzer şekilde sunulur. Ortak ilgi çekici özellikler pencerenin üst kısmındaki metin kutusunda sağlanır.Ancak değişkenlerinizi özelleştirmek istiyorsanız, metin kutusundaki her şeyi silmeniz ve aşağıda listelenen belirli özellikleri seçmeniz yeterlidir. Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde sonuç grafiğini seçin. Bundan sonra, iTACS kullanıcıya kullanıcının çizimi kırılmamış iz olan hücrelerle sınırlamak isteyip istemediğini sorar.Çizimi kırılmamış parçalarla sınırlamak istemiyorsanız, Hayır'ı tıklatın. iTACS en fazla üç değişken çizebilir ve bu durumda, bu faktörler arasındaki ilişkiyi görmek için yalnızca iki değişken çizeceğiz. Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde sonuç resmini seçin.Konum dizini buradadır ve tamamlandığında Seç'i tıklatın. iTACS daha sonra başlangıç çerçevesini seçmemizi ister. Burada, iki numaralı kareyi seçtik.Isı haritaları yapma seçenekleri, tek tek hücrelerin zaman izlerini çizme seçeneklerine benzer şekilde sunulur. Bununla, bir ısı haritasının nasıl yapılır olduğu sonucuna varıyoruz. Burada, bir numaralı hücre için sitoskeletal gerilimde hücresel hızın zaman izini temsil eder.Özellikler paylaşılan bir dikey eksende gösterilir ve yatay eksen, çerçevelerin 15 dakikalık aralıklarla alındığı zaman örneği numarasını gösterir. İkinci çıkış, deneye bir saat kala bir dizi ısı haritasıdır. Burada gösterilen özellikler yayılma alanı, oryantasyon, dairesellik, hız, hareket yönü, maksimum gerilim yönelimi, sitoskeletal gerilim, substrat çekişleri ve bireysel hücrelerin gerilim anizotropisini içerir.Yani bu bir dizi deneye bir bakış. AnViM ve AcTrM'nin kullanıcının deneyi tekrar tekrar yapmasına yardımcı olabileceği birkaç deneysel durum daha vardır ve bu kişiler el yazmasında listelenmiştir. iTACS'in temel özelliklerinden bazıları deneysel protokolün otomasyonu, otomatik veri analizi ve mühendislik arka planı gerekmez.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...