Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Heart, Lung, and Blood Institute of National Institutes of Health under tildeling numre K01HL135464 og R01HL151505 og af American Heart Association under tildeling nummer 19IPLOI34660342. Vi vil gerne takke MSU Advanced Microscopy Core og Dr. William Jackson på MSU Department of Pharmacology and Toxicology for adgang til konfokale mikroskoper, IQ Microscopy Core og MSU Genomics Core til sekventeringstjenester. Vi vil også gerne takke alle medlemmer af Aguirre Lab for deres værdifulde kommentarer og råd.

1. hPSC kultur og vedligeholdelse
BEMÆRK: De humant inducerede PSC'er (hiPSC'er) eller menneskelige embryonale stamceller (hESC'er) skal dyrkes i mindst 2 på hinanden følgende passager efter optøning, før de bruges til at generere EBs til differentiering eller yderligere kryopræservering. hPSCs er kultiveret i PSC medium (se tabellen over materialer) på kælder-membran-ekstracellulære matrix (BM-ECM)-belagt 6-brønd kultur plader. Når du udfører medium ændringer på h...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

Nylige fremskridt inden for human stamcelle-afledte kardiomyocytter og andre celler af hjerteoprindelse er blevet brugt til at modellere menneskets hjerteudvikling22,24,25 og sygdom26,27,28 og som værktøjer til at screene terapeutiske 29,30 og giftige agens31...

Medfødte hjertefejl (CHD'er) er den mest almindelige type medfødt defekt hos mennesker og påvirker ca. 1% af alle levendefødte1,2,3. Under de fleste omstændigheder er årsagerne til CHD'er fortsat ukendte. Evnen til at skabe menneskelige hjertemodeller i laboratoriet, der ligner det udviklende menneskelige hjerte, udgør et betydeligt skridt fremad for direkte at studere de underliggende årsager til CHD'er hos mennesker snarere end i surrogatdyrmodeller.
Indbegrebet af laboratoriedyrkede vævsmodeller er organoider, 3D-cellekonstruktioner, der ligner et organ af interesse for cellesammensætning og fysiologisk funktion. Organoider er ofte afledt af stamceller eller stamceller og er blevet anvendt med succes til at modellere mange organer såsom hjernen4,5, nyre6,7, tarm8,9, lung10,11, liver12,13, og bugspytkirtel14,15 , bare for at nævne nogle få. Nylige undersøgelser er dukket op, der viser muligheden for at skabe selvmontering af hjerteorganoider til at studere hjerteudvikling in vitro. Disse modeller omfatter brug af mus embryonale stamceller (mESCs) til at modellere tidlig hjerte udvikling16,17 op til atrioventrikulær specifikation18 og human pluripotente stamceller (hPSCs) til at generere multi-kim lag hjerte-endoderm organoider19 og chambered cardioider20 med meget kompleks cellulær sammensætning.
Dette papir præsenterer en ny 3-trins WNT graduering protokol til at generere meget komplekse hHOs på en effektiv og omkostningseffektiv måde. Organoider genereres i 96-brønd plader, hvilket resulterer i et skalerbart, high-throughput system, der let kan automatiseres. Denne metode er afhængig af at skabe hPSC aggregater og udløse udviklingsmæssige trin af kardiogenese, herunder mesoderm og hjerte mesoderm dannelse, første og andet hjerte felt specifikation, proepicardial organ dannelse, og atrioventricular specifikation. Efter 15 dages differentiering indeholder hHOs alle større celle slægter findes i hjertet, veldefinerede indre kamre, atrie og ventrikulære kamre, og et vaskulært netværk i hele organoid. Dette meget sofistikerede og reproducerbare hjerteorganoidsystem er modtageligt for at undersøge strukturelle, funktionelle, molekylære og transskriptomiske analyser i studiet af hjerteudvikling og sygdomme og farmakologisk screening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

Evnen til at studere menneskets hjerteudvikling i sundhed og sygdom er meget begrænset af evnen til at modellere kompleksiteten af det menneskelige hjerte in vitro. Udvikling af mere effektive organlignende platforme, der kan modellere komplekse in vivo-fænotyper , såsom organoider og organer-on-a-chip, vil forbedre evnen til at studere menneskelig hjerteudvikling og sygdom. Dette papir beskriver en protokol til at generere meget komplekse menneskelige hjerteorganoider (hHOs) af selvorganisering ved hjælp af menneskelige pluripotente stamceller og trinvis udviklingsforløb aktivering ved hjælp af små molekylehæmmere. Embryoid organer (EBs) er genereret i en 96-brønd plade med runde-bund, ultra-lav vedhæftet fil brønde, lette suspension kultur individualiserede konstruktioner.
EBs gennemgå differentiering i hHOs ved en tre-trins Wnt signalering graduering strategi, som indebærer en indledende Wnt vej aktivering for at fremkalde hjerte mesoderm skæbne, et andet trin af Wnt hæmning for at skabe endelige hjerte slægter, og en tredje Wnt aktivering skridt til at fremkalde proepicardial organvæv. Disse trin, udført i et 96-brønds format, er meget effektive, reproducerbare og producerer store mængder organoider pr. Løb. Analyse af immunofluorescence imaging fra dag 3 til dag 11 af differentiering afslører første og andet hjertefelt specifikationer og meget komplekse væv inde hHOs på dag 15, herunder myokardievæv med regioner af atrie og ventrikulære kardiomyocytter, samt interne kamre foret med endocardial væv. Organoiderne udviser også et indviklet vaskulært netværk gennem hele strukturen og en ekstern foring af epicardialt væv. Fra et funktionelt synspunkt slår hHOs robust og præsenterer normal calciumaktivitet som bestemt af Fluo-4 live imaging. Samlet set udgør denne protokol en solid platform for in vitro-studier i humane organlignende hjertevæv.

For at opnå selvorganiserende hHO in vitro ændrede vi og kombinerede differentieringsprotokoller, der tidligere var beskrevet for 2D monolayerdifferentiering af kardiomyocytter21 og epicardiale celler22 ved hjælp af Wnt-vejmodulatorer og til 3D præcardiac organoider16 ved hjælp af vækstfaktorerne BMP4 og Activin A. Ved hjælp af 96-brøndspladen EB og hHO differentiering protokol beskrevet her og vist i figur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Her beskriver vi en protokol til at skabe udviklingsrelevante menneskelige hjerteorganoider (hHOs) effektivt ved hjælp af menneskelige pluripotente stamceller fra selvorganisering. Protokollen er afhængig af sekventiel aktivering af udviklingsmæssige signaler og producerer meget komplekse, funktionelt relevante menneskelige hjertevæv.

Generering af selvopsamlende menneskehjerteorganoider afledt af pluripotente stamceller

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Denne protokol giver os mulighed for at skabe en kompleks 3D-struktur, der ligner det udviklende menneskelige hjerte på en enkel omkostningseffektiv måde, der kan reproduceres på tværs af cellelinjer. Den består af en enkelt protokol med tre trin af differentiering, som giver anledning til alle celletyper af hjertet, herunder kamre og et vaskulært netværk. Denne teknik giver os mulighed for at modellere en bred vifte af menneskelige hjerte-kar-sygdomme og til at screene effektive farmakologiske behandlinger.Takket være den høje gennemløb karakter af sit design. Denne metode er nyttig til at undersøge det udviklende menneskelige hjerte samt sygdomme, der almindeligvis er forbundet med det. En af dem er medfødte hjertefejl.Denne protokol kræver grundlæggende cellekultur færdigheder. Vi anbefaler opmærksom og delikat pipetter samt blid håndtering af organoiderne. Begynd med at skabe embryonale organer eller EBs to dage før differentiering.Vask sub-sammenflydende HPSCs med DBPS i mindst 10 sekunder. Så aspirere DPBS. Tilsæt en milliliter rumtemperatur ACUTA og tryk forsigtigt på pladen ca. fem gange hvert minut i tre til fem minutter for at fremkalde løsrivelse, mens du kontrollerer under mikroskopet.Tilsæt derefter en milliliter PSC medium og Thias Avin eller Thias for at stoppe reaktionen. Pipette medierne op og ned i brønden, to til tre gange for at generere en enkelt celle suspension og indsamle cellerne. Overfør derefter enkeltcelleaffjedringen til et centrifugerør og drej i fem minutter ved 300 gange G.Aspirate supernatanten og genforbrug cellerne i en milliliter PSC medium og Thias.Fortynd cellerne i DPBS. Tæl cellerne ved hjælp af en celletæller eller hæmocyster og fortynd cellerne i PSC medium med Thias til en koncentration på 100.000 celler pr. milliliter. Tilsæt 100 mikroliter af fortyndede celler suspension til hver brønd af en rund bund ultra lav vedhæftet fil 96 godt plade.Centrifuge pladen ved 100 gange G i tre minutter og inkubere i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter 24 timer forsigtigt fjerne 50 mikroliter af medium fra hver brønd og tilsæt 200 kerne kuld af friske PSC medium, varm til 37 grader Celsius for et volumen på 250 mikroliter per brønd. Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Fjern 166 mikroliter eller to tredjedele af medium fra den ene side af hver brønd, og tilsæt 166 mikroliters af RPMI 1640 indeholdende insulinfri B27 supplement, seks mikromolar jubel 990211, 0,875 nanogram per milliliter knoglemorfogenetisk protein fire og 1,5 nanogram per milliliter af Activin A.Incubate i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter 24 timer fjernes 166 mikroliter af medium fra den ene side af hver brønd og tilsættes 166 mikroliter frisk RPMI 1640 med insulinfrit B27-supplement. Inkuber i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.For at fremkalde hjerte mesoderm specifikation på dag to, fjerne 166 mikroliter af medium fra hver brønd og tilføje 166 mikroliter af RPMI 1640, der indeholder insulinfri B27 supplement og tre mikromolar Wnt-C59 og fortsætte inkubation i 48 timer. På dag fire skal du fjerne 166 mikroliter af medium fra hver brønd og tilsætte 166 mikroliter frisk RPMI 1640 med insulinfrit B27-supplement og derefter inkubere yderligere 48 timer. På dag seks, fjerne 166 mikroliter af medium fra hver brønd og tilføje 166 mikroliter af RPMI 1640 med B27 supplement.Til dette og alle efterfølgende medieændringer skal du bruge B27-tillæg med insulin, inkubere i yderligere 24 timer. På dag syv er cellekulturen klar til pro epicardial differentiering. Fjern 166 mikroliter af medium fra hver brønd og tilsæt 166 mikroliter af friske RPMI 1640 indeholdende B27 supplement og tre mikromolar juble 99021.Derefter fjernes 166 mikroliter af medium i en time efter en time pladen fra inkubatoren 166 mikroliter af medium fra den ene side af hver brønd og tilsæt 166 mikroliter frisk RPMI 1640 indeholdende B27-supplement fortsætter inkubationen i yderligere 48 timer. Gentag denne proces os hver 48 timer indtil indsamling. Organoider er klar til analyser og eksperimenter på dag 15 For at overføre hele organoiderne skæres spidsen af en P200 pipette, fem til 10 millimeter fra åbningen med en diameter på ca. to til tre millimeter.Tryk på pipettekaster og sæt spidsen lodret ind i den runde bund godt med organoiden. Tag op ca. 100 til 200 mikroliter af medium nok til at indsamle organoider og overføre dem til måldestinationen. Før differentiering EBS fremstår som sorte sfæriske masser, starter differentieringsprocessen på dag nul med en Wnt-vejaktivering og vækstfaktortilføjelse i præcis 24 timer.Yderligere redigering af Wnt C59 på dag to resulterer i udvidelsen af organoid fra ca 200 mikrometer til højst en millimeter. De menneskelige hjerteorganoider begyndte at slå så tidligt som dag seks og 100% af organoiderne viste synlige slag ved dag 10. Høj forstørrelse billeder af dag syv organoid afslørede, at de fleste hånd en udtrykke celler var kardiomyocyt i oprindelse og hånd to var ikke myosite celler fra anden Heartfield, stamfader celler.RNA udskrifter for både hånd en og hånd to blev udtrykt fra dag tre og fremefter i RNA sekventering data. FHF's markører var stærkt udtrykt i dag tre og 11, mens SF's markør var mere udtalt efter dag 13. Immunofluorescence plet afslørede tilstedeværelsen af forskellige menneskelige hjerte celle type slægter, der udgør det menneskelige hjerte.Såsom myokardie- og epicardialvæv, endocardialceller, endotelceller og hjertefibroblast. De markører, der udtrykker ovenstående celle slægter blev også observeret i RNA SAC genekspression profiler. Levende calciumbilleddannelse af individuelle celler i hele organoider blev brugt til at måle organoidernes elektrofysiologiske funktion.Fluo-4 fluorescens intensitet varierede over tid på grund af calcium indrejse exit fra cellen afslører regelmæssig handling potentialer. Varmekort, der viser calciumintensiteter over et højt forstørrelsesområde af organoiden, viser øget intensitet på grund af calciumtransienter og individuelle celler. Når du forsøger denne protokol, skal du huske på, at EBs og efterfølgende organoider ikke er fastgjort til bunden af pladen, og vi vil bevæge os rundt med fjernelse ud over medier, der kræver opmærksomme medieændringer.Organoider kan være kultur i længere tid indført til modningsteknikker eller endda udsat for eksterne stimuli, såsom mekanisk eller elektrisk konditionering, og endda stressorer som toksiner. Denne teknik giver som adgang til stadier af menneskets fosterhjerteudvikling, der ellers er utilgængelige i forskning, hvilket baner vejen for ny indsigt i hjerteudvikling og sygdomsetiologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Berigelse af Detergent-uopløselige Protein aggregater fra Postmortem menneskehjerne

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting-protokollen for et lille antal hæmatopoietisk stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Hurtig Isolation af Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteom og miRNA analyse af Polysomes fra isolerede mus hjertet efter Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Forbedring af engraftment af humane inducerede pluripotente stamcelle afledte Kardiomyocytter via en forbigående hæmning af Rho Kinaseaktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseudtømning som et indirekte mål for glukoseoptagelse i celler og væv Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Human mesenkymal stamcellebehandling til kliniske applikationer ved hjælp af en lukket semi-automatiseret arbejdsgang

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...