Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder de awardnummers K01HL135464 en R01HL151505 en door de American Heart Association onder awardnummer 19IPLOI34660342. We willen de MSU Advanced Microscopy Core en Dr. William Jackson van de MSU Department of Pharmacology and Toxicology bedanken voor toegang tot confocale microscopen, de IQ Microscopy Core en de MSU Genomics Core voor sequencingdiensten. We willen ook alle leden van het Aguirre Lab bedanken voor hun waardevolle opmerkingen en advies.

1. hPSC cultuur en onderhoud
OPMERKING: De door de mens geïnduceerde PSC's (hiPSC's) of menselijke embryonale stamcellen (hESCs) moeten gedurende ten minste 2 opeenvolgende passages na het ontdooien worden gekweekt voordat ze worden gebruikt om EB's te genereren voor differentiatie of verdere cryopreservatie. hPSC's worden gekweekt in PSC-medium (zie de tabel met materialen) op keldermembraan-extracellulaire matrix (BM-ECM)-gecoate 6-well kweekplaten. Bij het uitvoeren van medi...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

Recente ontwikkelingen in van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten en andere cellen van cardiale oorsprong zijn gebruikt om de ontwikkeling van het menselijk hart22,24,25 en ziekte26,27,28 te modelleren en als hulpmiddelen om therapeutica29,30 en toxische agentia <sup...

Aangeboren hartafwijkingen (CHD's) zijn het meest voorkomende type aangeboren afwijking bij de mens en treffen ongeveer 1% van alle levendgeborenen1,2,3. Onder de meeste omstandigheden blijven de redenen voor CHD's onbekend. Het vermogen om menselijke hartmodellen in het laboratorium te maken die sterk lijken op het zich ontwikkelende menselijke hart, vormt een belangrijke stap voorwaarts om de onderliggende oorzaken van CHD's bij mensen rechtstreeks te bestuderen in plaats van in surrogaatdiermodellen.
De belichaming van in het laboratorium gekweekte weefselmodellen zijn organoïden, 3D-celconstructies die lijken op een orgaan dat van belang is voor de celsamenstelling en fysiologische functie. Organoïden zijn vaak afgeleid van stamcellen of voorlopercellen en zijn met succes gebruikt om vele organen te modelleren, zoals de hersenen4,5, nier6,7, darm8,9, long10,11, lever12,13 en pancreas14,15 , om er maar een paar te noemen. Recente studies zijn naar voren gekomen die de haalbaarheid aantonen van het creëren van zelfassemblerende hartorganoïden om de hartontwikkeling in vitro te bestuderen. Deze modellen omvatten het gebruik van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) om vroege hartontwikkeling te modelleren16,17 tot atrioventriculaire specificatie18 en menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) om multi-kiemlaag cardiale endoderm organoïden19 en gekamerde cardioïden20 met zeer complexe cellulaire samenstelling te genereren.
Dit artikel presenteert een nieuw 3-staps WNT-modulatieprotocol om zeer complexe hHO's op een efficiënte en kosteneffectieve manier te genereren. Organoïden worden gegenereerd in 96-well platen, wat resulteert in een schaalbaar, high-throughput systeem dat eenvoudig kan worden geautomatiseerd. Deze methode is gebaseerd op het creëren van hPSC-aggregaten en het activeren van ontwikkelingsstappen van cardiogenese, waaronder mesoderm- en cardiale mesodermvorming, eerste en tweede hartveldspecificatie, pro-epicardiale orgaanvorming en atrioventriculaire specificatie. Na 15 dagen differentiatie bevatten hHO's alle belangrijke cellijnen in het hart, goed gedefinieerde interne kamers, atriale en ventriculaire kamers en een vasculair netwerk in de organoïde. Dit zeer geavanceerde en reproduceerbare hartorganoïde systeem is vatbaar voor het onderzoeken van structurele, functionele, moleculaire en transcriptomische analyses in de studie van hartontwikkeling en ziekten en farmacologische screening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

Het vermogen om de ontwikkeling van het menselijk hart in gezondheid en ziekte te bestuderen, wordt sterk beperkt door het vermogen om de complexiteit van het menselijk hart in vitro te modelleren. Het ontwikkelen van efficiëntere orgaanachtige platforms die complexe in vivo fenotypen kunnen modelleren, zoals organoïden en organen-op-een-chip, zal het vermogen om de ontwikkeling en ziekte van het menselijk hart te bestuderen verbeteren. Dit artikel beschrijft een protocol om zeer complexe menselijke hartorganoïden (hHO's) te genereren door zelforganisatie met behulp van menselijke pluripotente stamcellen en stapsgewijze ontwikkelingswegactivering met behulp van kleine molecuulremmers. Embryoïde lichamen (EB's) worden gegenereerd in een 96-well plaat met ronde bodem, ultra-lage bevestigingsputten, waardoor de suspensiecultuur van geïndividualiseerde constructies wordt vergemakkelijkt.
De EB's ondergaan differentiatie in hHO's door een driestaps Wnt-signaleringsmodulatiestrategie, die een initiële Wnt-routeactivering omvat om het lot van het cardiale mesoderm te induceren, een tweede stap van Wnt-remming om definitieve cardiale afstammingslijnen te creëren en een derde Wnt-activeringsstap om pro-epicardiale orgaanweefsels te induceren. Deze stappen, uitgevoerd in een 96-well formaat, zijn zeer efficiënt, reproduceerbaar en produceren grote hoeveelheden organoïden per run. Analyse door immunofluorescentie beeldvorming van dag 3 tot dag 11 van differentiatie onthult eerste en tweede hartveldspecificaties en zeer complexe weefsels in hHO's op dag 15, inclusief myocardiaal weefsel met regio's van atriale en ventriculaire cardiomyocyten, evenals interne kamers bekleed met endocardiaal weefsel. De organoïden vertonen ook een ingewikkeld vasculair netwerk door de hele structuur en een externe bekleding van epicardiaal weefsel. Vanuit functioneel oogpunt kloppen hHO's robuust en vertonen ze een normale calciumactiviteit zoals bepaald door Fluo-4 live imaging. Over het algemeen vormt dit protocol een solide platform voor in vitro studies in menselijke orgaanachtige hartweefsels.

Om zelforganiserende hHO in vitro te bereiken, hebben we differentiatieprotocollen aangepast en gecombineerd die eerder zijn beschreven voor 2D-monolaagdifferentiatie van cardiomyocyten21 en epicardiale cellen22 met behulp van Wnt-routemodulatoren en voor 3D-precardiale organoïden16 met behulp van de groeifactoren BMP4 en Activine A. Met behulp van het 96-well plate EB- en hHO-differentiatieprotocol dat hier wordt beschreven en getoond in <...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Hier beschrijven we een protocol om ontwikkelingsrelevante menselijke hartorganoïden (hHO's) efficiënt te maken met behulp van menselijke pluripotente stamcellen door zelforganisatie. Het protocol is gebaseerd op de sequentiële activering van ontwikkelingssignalen en produceert zeer complexe, functioneel relevante menselijke hartweefsels.

Het genereren van zelfassemblerende organoïden voor het menselijk hart afgeleid van pluripotente stamcellen

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Dit protocol stelt ons in staat om een complexe 3D-structuur te creëren die sterk lijkt op het zich ontwikkelende menselijke hart op een eenvoudige kosteneffectieve manier, die reproduceerbaar is over cellijnen. Het bestaat uit een enkel protocol met drie stappen van differentiatie, die aanleiding geeft tot alle celtypen van het hart, inclusief kamers en een vasculair netwerk. Deze techniek stelt ons in staat om een breed scala aan menselijke hart- en vaatziekten te modelleren en effectieve farmacologische behandelingen te screenen.Dankzij de hoge doorvoer van het ontwerp. Deze methode is nuttig voor het onderzoeken van het zich ontwikkelende menselijke hart en ziekten die er vaak mee worden geassocieerd. Een daarvan zijn aangeboren hartafwijkingen.Dit protocol vereist basis celkweekvaardigheden. We raden aandachtig en delicaat pipetteren aan, evenals een voorzichtige behandeling van de organoïden. Begin met het creëren van embryoïde lichamen of EB's twee dagen voor differentiatie.Was sub-confluente HPSC's met DBPS gedurende ten minste 10 seconden. Aspirateer dan de DPBS. Voeg een milliliter ACUTA bij kamertemperatuur toe en tik ongeveer vijf keer per minuut gedurende drie tot vijf minuten zachtjes op de plaat om loslating te veroorzaken, terwijl u dit onder de microscoop controleert.Voeg vervolgens een milliliter PSC-medium en Thias Avin of Thias toe om de reactie te stoppen. Pipetteer de media twee tot drie keer op en neer in de put om een enkele celsuspensie te genereren en de cellen te verzamelen. Breng vervolgens de eencellige suspensie over naar een centrifugebuis en draai gedurende vijf minuten op 300 keer G.Aspirateer het supernatant en besteed de cellen opnieuw in één milliliter PSC-medium en Thias.Verdun de cellen in DPBS. Tel de cellen met behulp van een celteller of hemocysteometer en verdun de cellen in PSC-medium met Thias tot een concentratie van 100.000 cellen per milliliter. Voeg 100 microliter verdunde cellen suspensie toe aan elke put van een ronde bodem ultra lage bevestiging 96 putplaat.Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten op 100 keer G en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder na 24 uur voorzichtig 50 microliter medium uit elke put en voeg 200 kernstrooisels van vers PSC-medium toe, warm tot 37 graden Celsius voor een volume van 250 microliter per put. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Verwijder 166 microliter of twee derde van het medium van één kant van elke put en voeg 166 microliter RPMI 1640 toe met insulinevrij B27-supplement, zes micromolaire cheer 990211, 0,875 nanogram per milliliter botmorfogenetisch eiwit vier en 1,5 nanogram per milliliter Activin A.Incubate gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder na 24 uur 166 microliter medium van één kant van elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 toe met insulinevrij B27-supplement. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Om de cardiale mesodermspecificatie op dag twee te induceren, verwijdert u 166 microliter medium uit elke put en voegt u 166 microliter RPMI 1640 toe, met insulinevrij B27-supplement en drie micromolaire Wnt-C59 en gaat u door met incubatie gedurende 48 uur. Verwijder op dag vier 166 microliter medium uit elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 toe met insulinevrij B27-supplement en incubeer vervolgens nog eens 48 uur. Verwijder op dag zes 166 microliter medium uit elke put en voeg 166 microliter RPMI 1640 toe met B27-supplement.Gebruik voor deze en alle daaropvolgende mediaveranderingen B27-supplement met insuline, incubateer nog eens 24 uur. Op dag zeven is de celkweek klaar voor pro-epicardiale differentiatie. Verwijder 166 microliter medium uit elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 met B27-supplement en drie micromolaire cheer 99021 toe.Haal vervolgens in incubateer gedurende een uur, verwijder na een uur de plaat uit de incubator, verwijder 166 microliter medium van één kant van elke put en voeg 166 microliter verse RPMI 1640 met B27-supplement toe, ga nog 48 uur door met incubatie. Herhaal dit proces elke 48 uur tot de ophaling. Organoïden zijn klaar voor analyse en experimenten op dag 15 Om de hele organoïden over te brengen, snijdt u de punt van een P200-pipet, vijf tot 10 millimeter van de opening met een diameter van ongeveer twee tot drie millimeter.Druk op de pipetzuiger en steek de punt verticaal in de ronde bodem goed met de organoid. Neem ongeveer 100 tot 200 microliter medium genoeg in beslag om de organoïden te verzamelen en over te brengen naar de doelbestemming. Voordat differentiatie EBS verschijnt als zwarten bolvormige massa's begint het differentiatieproces op dag nul met een Wnt pathway activatie en groeifactor optelling gedurende precies 24 uur.Verder resulteert de bewerking van Wnt C59 op dag twee in een vergroting van de organoïde van ongeveer 200 micrometer tot maximaal één millimeter. De organoïden van het menselijk hart begonnen al op dag zes te kloppen en 100% van de organoïden vertoonde zichtbaar kloppen op dag 10. Hoge vergrotingsbeelden van dag zeven organoïde onthulden dat de meeste hand één tot expressie brengende cellen cardiomyocyten van oorsprong waren en hand twee niet-myosietcellen uit tweede Heartfield, voorlopercellen.RNA-transcripten voor zowel hand één als hand twee werden vanaf dag drie uitgedrukt in RNA-sequencinggegevens. De FHF-markers werden sterk uitgedrukt tijdens dag drie en 11, terwijl de SF-marker na dag 13 sterker tot expressie kwam. Immunofluorescentievlek onthulde de aanwezigheid van verschillende menselijke hartceltype-type afstammingslijnen die deel uitmaken van het menselijk hart.Zoals myocardiaal en epicardiaal weefsel, endocardiale cellen, endotheelcellen en cardiale fibroblast. De markers die de bovenstaande cellijningen tot expressie brengen, werden ook waargenomen in de RNA SAC-genexpressieprofielen. Live calciumbeeldvorming van individuele cellen in hele organoïden werd gebruikt om de elektrofysiologische functie van de organoïden te meten.De fluorescentie-intensiteit van Fluo-4 varieerde in de loop van de tijd als gevolg van het verlaten van calcium uit de cel en het onthullen van regelmatige actiepotentialen. Heatmaps die calciumintensiteiten tonen over een gebied met hoge vergroting van de organoïde, tonen een verhoogde intensiteit als gevolg van calciumtransiënten en individuele cellen. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat de EB's en daaropvolgende organoïden niet aan de onderkant van de plaat zijn bevestigd en dat we zullen rondgaan met de verwijdering naast media die aandachtige mediaveranderingen vereisen.Organoïden kunnen gedurende langere tijd worden gekweekt en worden geïntroduceerd in rijpingstechnieken, of zelfs worden blootgesteld aan externe stimuli, zoals mechanische of elektrische conditionering, en zelfs stressoren zoals toxines. Deze techniek biedt toegang tot stadia van de ontwikkeling van het menselijk foetaal hart die anders ontoegankelijk zijn in onderzoek, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor nieuwe inzichten in hartontwikkeling en ziekte-etiologie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulaire glucosedepletie als een indirecte maat voor glucoseopname in cellen en weefsels Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Menselijke mesenchymale stamcelverwerking voor klinische toepassingen met behulp van een gesloten semi-geautomatiseerde workflow

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...