Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous les numéros de prix K01HL135464 et R01HL151505 et par l’American Heart Association sous le numéro de prix 19IPLOI34660342. Nous tenons à remercier le noyau de microscopie avancée de MSU et le Dr William Jackson du département de pharmacologie et de toxicologie de MSU pour l’accès aux microscopes confocaux, au noyau de microscopie IQ et au noyau de génomique MSU pour les services de séquençage. Nous tenons également à remercier tous les membres du Laboratoire Aguirre pour leurs précieux commentaires et conseils.

1. Culture et maintenance des CSEh
REMARQUE: Les CSP d’origine humaine (hiPSC) ou les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) doivent être cultivées pendant au moins 2 passages consécutifs après décongélation avant d’être utilisées pour générer des EB en vue de leur différenciation ou d’une cryoconservation ultérieure. Les cSEh sont cultivés dans un milieu PSC (voir le Tableau des matériaux) sur des plaques de culture à 6 puits revêtues de matrice ex...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

Les progrès récents dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines et d’autres cellules d’origine cardiaque ont été utilisés pour modéliser le développement cardiaque humain22,24,25 et la maladie26,27,28 et comme outils pour dépister les agents thérapeutiques29,30<sup class...

Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et affectent environ 1% de toutes les naissances vivantes1,2,3. Dans la plupart des cas, les raisons des maladies coronariennes demeurent inconnues. La capacité de créer des modèles cardiaques humains en laboratoire qui ressemblent étroitement au cœur humain en développement constitue un pas en avant important pour étudier directement les causes sous-jacentes des maladies coronariennes chez l’homme plutôt que dans des modèles animaux de substitution.
La quintessence des modèles tissulaires cultivés en laboratoire sont les organoïdes, des constructions cellulaires 3D qui ressemblent à un organe d’intérêt pour la composition cellulaire et la fonction physiologique. Les organoïdes sont souvent dérivés de cellules souches ou de cellules progénitrices et ont été utilisés avec succès pour modéliser de nombreux organes tels que le cerveau4,5, le rein6,7, l’intestin8,9, le poumon10,11, le foie12,13 et le pancréas14,15 , pour n’en nommer que quelques-uns. Des études récentes ont émergé démontrant la faisabilité de créer des organoïdes cardiaques auto-assemblés pour étudier le développement cardiaque in vitro. Ces modèles comprennent l’utilisation de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris pour modéliser le développement cardiaque précoce16,17 jusqu’à la spécification auriculo-ventriculaire18 et de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) pour générer des organoïdes cardio-endodermiques multi-germinaux19 et des cardioïdes chambrés20 avec une composition cellulaire très complexe.
Cet article présente un nouveau protocole de modulation WNT en 3 étapes pour générer des hHO très complexes de manière efficace et rentable. Les organoïdes sont générés dans des plaques de 96 puits, ce qui donne un système évolutif à haut débit qui peut être facilement automatisé. Cette méthode repose sur la création d’agrégats hPSC et le déclenchement des étapes de développement de la cardiogenèse, y compris la formation du mésoderme et du mésoderme cardiaque, la spécification du premier et du deuxième champ cardiaque, la formation d’organes proépicardiques et la spécification auriculo-ventriculaire. Après 15 jours de différenciation, les hHO contiennent toutes les principales lignées cellulaires présentes dans le cœur, des chambres internes bien définies, des chambres auriculaires et ventriculaires et un réseau vasculaire dans tout l’organoïde. Ce système organoïde cardiaque hautement sophistiqué et reproductible se prête à l’étude d’analyses structurelles, fonctionnelles, moléculaires et transcriptomiques dans l’étude du développement cardiaque, des maladies et du dépistage pharmacologique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

La capacité d’étudier le développement cardiaque humain dans la santé et la maladie est fortement limitée par la capacité de modéliser la complexité du cœur humain in vitro. Le développement de plateformes plus efficaces semblables à des organes capables de modéliser des phénotypes in vivo complexes, tels que des organoïdes et des organes sur puce, améliorera la capacité d’étudier le développement cardiaque humain et les maladies. Cet article décrit un protocole pour générer des organoïdes cardiaques humains (hHO) très complexes par auto-organisation à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines et activation progressive de la voie de développement à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules. Les corps embryoïdes (EB) sont générés dans une plaque de 96 puits avec des puits à fond rond et à fixation ultra-basse, facilitant la culture en suspension de constructions individualisées.
Les EB subissent une différenciation en hHO par une stratégie de modulation de signalisation Wnt en trois étapes, qui implique une activation initiale de la voie Wnt pour induire le destin du mésoderme cardiaque, une deuxième étape d’inhibition Wnt pour créer des lignées cardiaques définitives et une troisième étape d’activation Wnt pour induire des tissus d’organes proépicardiques. Ces étapes, réalisées dans un format de 96 puits, sont très efficaces, reproductibles et produisent de grandes quantités d’organoïdes par course. L’analyse par imagerie par immunofluorescence du jour 3 au jour 11 de la différenciation révèle les première et deuxième spécifications du champ cardiaque et les tissus très complexes à l’intérieur des hHO au jour 15, y compris le tissu myocardique avec des régions de cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires, ainsi que des chambres internes tapissées de tissu endocardique. Les organoïdes présentent également un réseau vasculaire complexe dans toute la structure et une paroi externe du tissu épicardique. D’un point de vue fonctionnel, les hHO battent de manière robuste et présentent une activité calcique normale déterminée par l’imagerie en direct Fluo-4. Dans l’ensemble, ce protocole constitue une plate-forme solide pour les études in vitro dans les tissus cardiaques humains ressemblant à des organes.

Pour obtenir un hHO auto-organisé in vitro, nous avons modifié et combiné les protocoles de différenciation précédemment décrits pour la différenciation monocouche 2D des cardiomyocytes21 et des cellules épicardiques22 à l’aide de modulateurs de la voie Wnt et pour les organoïdes précardiaques 3D16 en utilisant les facteurs de croissance BMP4 et Activin A. En utilisant le protocole de différenciation EB et hHO à 96 puits déc...

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Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Ici, nous décrivons un protocole pour créer des organoïdes cardiaques humains (hHO) pertinents pour le développement en utilisant efficacement des cellules souches pluripotentes humaines par auto-organisation. Le protocole repose sur l’activation séquentielle des signaux de développement et produit des tissus cardiaques humains très complexes et fonctionnellement pertinents.

Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés dérivés de cellules souches pluripotentes

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Ce protocole nous permet de créer une structure 3D complexe qui ressemble beaucoup au cœur humain en développement d’une manière simple et rentable, reproductible à travers les lignées cellulaires. Il se compose d’un seul protocole avec trois étapes de différenciation, qui donne naissance à tous les types de cellules du cœur, y compris les chambres et un réseau vasculaire. Cette technique nous permet de modéliser un large éventail de maladies cardiovasculaires humaines et de dépister des traitements pharmacologiques efficaces.Grâce à la nature à haut débit de sa conception. Cette méthode est utile pour étudier le cœur humain en développement ainsi que les maladies qui lui sont couramment associées. L’un d’eux étant les malformations cardiaques congénitales.Ce protocole nécessite des compétences de base en culture cellulaire. Nous recommandons un pipetage attentif et délicat ainsi qu’une manipulation douce des organoïdes. Commencez par créer des corps embryoïdes ou EB deux jours avant la différenciation.Lavez les HPSC sous-confluents avec DBPS pendant au moins 10 secondes. Ensuite, aspirez le DPBS. Ajouter un millilitre d’ACUTA à température ambiante et tapoter doucement la plaque environ cinq fois par minute pendant trois à cinq minutes pour induire un détachement, tout en vérifiant au microscope.Ajoutez ensuite un millilitre de milieu PSC et Thias Avin ou Thias pour arrêter la réaction. Pipeter le milieu de haut en bas dans le puits, deux à trois fois pour générer une suspension à cellule unique et recueillir les cellules. Ensuite, transférez la suspension à cellule unique dans un tube de centrifugeuse et faites tourner pendant cinq minutes à 300 fois G.Aspirez le surnageant et ré-dépensez les cellules dans un millilitre de milieu PSC et de Thias.Diluer les cellules dans DPBS. Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémo-cystomètre et diluer les cellules dans un milieu PSC avec Thias à une concentration de 100 000 cellules par millilitre. Ajouter 100 microlitres de suspension de cellules diluées à chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond ultra basse.Centrifuger la plaque à 100 fois G pendant trois minutes et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, retirez soigneusement 50 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 200 portées de noyau de milieu PSC frais, chaud à 37 degrés Celsius pour un volume de 250 microlitres par puits. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Retirez 166 microlitres ou deux tiers de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 contenant un supplément de B27 sans insuline, six 990211 de cheer micromolaires, 0,875 nanogramme par millilitre de protéine morphogénétique osseuse quatre et 1,5 nanogrammes par millilitre d’Activin A.Incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, retirez 166 microlitres de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais avec un supplément de B27 sans insuline. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour induire la spécification du mésoderme cardiaque le deuxième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640, contenant un supplément de B27 sans insuline et trois Wnt-C59 micromolaires et poursuivez l’incubation pendant 48 heures. Le quatrième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais avec un supplément de B27 sans insuline, puis incubez encore 48 heures. Le sixième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 avec un supplément de B27.Pour cela et tous les changements de milieu ultérieurs, utilisez un supplément de B27 avec de l’insuline, incubez pendant 24 heures supplémentaires. Le septième jour, la culture cellulaire est prête pour la différenciation pro épicardique. Retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B27 et trois cheer micromolaires 99021.Ensuite, en incubant pendant une heure, après une heure, retirez la plaque de l’incubateur, retirez 166 microlitres de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B27, continuez l’incubation pendant encore 48 heures. Répétez ce processus toutes les 48 heures jusqu’à la collecte. Les organoïdes sont prêts pour les analyses et l’expérimentation le jour 15 Pour transférer les organoïdes entiers, coupez l’extrémité d’une pipette P200, à cinq à 10 millimètres de l’ouverture d’un diamètre d’environ deux à trois millimètres.Appuyez sur le piston de la pipette et insérez la pointe verticalement dans le puits inférieur rond avec l’organoïde. Prenez environ 100 à 200 microlitres de milieu suffisamment pour recueillir les organoïdes et les transférer à la destination cible. Avant que les EBS de différenciation n’apparaissent sous forme de masses sphériques noires, le processus de différenciation commence le jour zéro avec une activation de la voie Wnt et un ajout de facteur de croissance pendant exactement 24 heures.En outre, l’édition de Wnt C59 le deuxième jour entraîne l’élargissement de l’organoïde d’environ 200 micromètres à un maximum d’un millimètre. Les organoïdes du cœur humain ont commencé à battre dès le sixième jour et 100% des organoïdes ont montré des battements visibles au jour 10. Les images à fort grossissement de l’organoïde du septième jour ont révélé que la plupart des cellules exprimant la main un étaient d’origine cardiomyocytaire et la main deux étaient des cellules non myosites du deuxième Heartfield, des cellules progénitrices.Les transcriptions d’ARN pour la première main et la deuxième main ont été exprimées à partir du troisième jour dans les données de séquençage de l’ARN. Les marqueurs FHF ont été fortement exprimés pendant les jours trois et 11 tandis que le marqueur SF a été exprimé plus fortement après le jour 13. La coloration par immunofluorescence a révélé la présence de diverses lignées de type de cellules cardiaques humaines qui composent le cœur humain.Tels que le tissu myocardique et épicardique, les cellules endocardiques, les cellules endothéliales et les fibroblastes cardiaques. Les marqueurs exprimant les lignées cellulaires ci-dessus ont également été observés dans les profils d’expression génique de l’ARN SAC. L’imagerie calcique vivante de cellules individuelles dans des organoïdes entiers a été utilisée pour mesurer la fonction électrophysiologique des organoïdes.L’intensité de la fluorescence Fluo-4 a varié au fil du temps en raison de l’entrée de calcium hors de la cellule révélant des potentiels d’action réguliers. Les cartes thermiques montrant les intensités de calcium sur une région de grossissement élevé de l’organoïde montrent une intensité accrue due aux transitoires de calcium et aux cellules individuelles. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que les EB et les organoïdes suivants ne sont pas attachés au bas de la plaque, et nous nous déplacerons avec le retrait en plus des supports nécessitant des changements de support attentifs.Les organoïdes peuvent être cultivés pendant de plus longues périodes de temps introduites dans les techniques de maturation, ou même exposés à des stimuli externes, tels que le conditionnement mécanique ou électrique, et même à des facteurs de stress tels que les toxines. Cette technique permet d’accéder à des stades du développement cardiaque fœtal humain qui sont autrement inaccessibles dans la recherche, ouvrant la voie à de nouvelles connaissances sur le développement cardiaque et l’étiologie des maladies.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocole optimisé pour l&#39;extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Recherche

Biochimie

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Isolation rapide de la Mitoribosome de cellules HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Améliorer l'engraftment des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme par l'intermédiaire d'une inhibition transitoire de l'activité de Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

L’épuisement extracellulaire du glucose comme mesure indirecte de l’absorption du glucose dans les cellules et les tissus Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Traitement des cellules souches mésenchymateuses humaines pour des applications cliniques à l’aide d’un flux de travail semi-automatisé fermé

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...