Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מכון הלב, הריאות והדם הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרסים K01HL135464 ו- R01HL151505 ועל ידי איגוד הלב האמריקאי תחת פרס מספר 19IPLOI3660342. אנו מבקשים להודות לליבת המיקרוסקופיה המתקדמת של MSU וד"ר ויליאם ג'קסון במחלקת MSU לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה על גישה למיקרוסקופים קונפוקליים, לליבת המיקרוסקופיה של IQ ולליבה הגנומית של MSU עבור שירותי רצף. אנו גם רוצים להודות לכל חברי מעבדת אגירה על הערותיהם ועצותיהם החשובות.

1. תרבות ותחזוקה של hPSC
הערה: מחשבי PC המושרה האנושי (hiPSCs) או תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) צריכים להיות מתורבתים לפחות 2 מעברים רצופים לאחר הפשרה לפני השימוש כדי ליצור EBs עבור בידול או הזעקה נוספת. h hPSCs מתורבתים במדיום PSC (ראה טבלת החומרים) על מטריצה חוץ-תאית במרתף (BM-ECM) מצו?...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

ההתקדמות האחרונה בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע אנושיים ובתאים אחרים ממוצא לבבי שימשו למודל התפתחות הלב האנושי22,24,25 ומחלות26,27,28 וכלים לבדיקת טיפולים29,30</sup...

מומים מולדים בלב (CHDs) הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם מולד בבני אדם ומשפיעים על כ -1% מכלל הלידות החיות1,2,3. ברוב הנסיבות, הסיבות ל- CHDs עדיין אינן ידועות. היכולת ליצור מודלים של לב אנושי במעבדה הדומים מאוד ללב האנושי המתפתח מהווה צעד משמעותי קדימה כדי לחקור ישירות את הגורמים הבסיסיים של CHDs בבני אדם ולא במודלים של בעלי חיים פונדקאיים.
התגלמות מודלים של רקמות שגודלו במעבדה הם אורגנוידים, מבני תאים תלת-ממדיים הדומים לאיבר בעל עניין בהרכב התא ובתפקוד הפיזיולוגי. אורגנואידים נגזרים לעתים קרובות מתאי גזע או מתאי אבות ונעשה בהם שימוש מוצלח לדגמן איברים רבים כגון המוח4,5, כליות6,7, מעיים8,9, ריאה10,11, כבד12,13 ולבלב14,15 רק כדי להזכיר כמה., מחקרים אחרונים הופיעו מדגים את ההיתכנות של יצירת organoids לב להרכיב עצמית ללמוד התפתחות הלב במבחנה. מודלים אלה כוללים שימוש בתאי גזע עובריים של עכבר (mESCs) כדי לדגמן פיתוח לב מוקדם16,17 עד מפרט atrioventricular18 ותאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים (hPSCs) כדי ליצור organoids לב-אנדודרם שכבת רב-נבט19 וקרדיואידים תאיים20 עם הרכב תאי מורכב מאוד.
מאמר זה מציג פרוטוקול אפנון WNT חדשני בן 3 שלבים כדי ליצור hHOs מורכבים מאוד באופן יעיל וחסכוני. Organoids נוצרים לוחות 96-well, וכתוצאה מכך מערכת מדרגית, תפוקה גבוהה שניתן להפוך לאוטומטית בקלות. שיטה זו מסתמכת על יצירת אגרגטים hPSC והפעלת צעדים התפתחותיים של cardiogenesis, כולל היווצרות mesoderm ו mesoderm לב, מפרט שדה הלב הראשון והשני, היווצרות איברים proepicardial, מפרט atrioventricular. לאחר 15 ימים של בידול, hHOs מכילים את כל שושלות התא העיקריות שנמצאו בלב, תאים פנימיים מוגדרים היטב, תאי פרזדורים וחדריים, ורשת כלי דם ברחבי האורגנויד. מערכת אורגנויד לב מתוחכמת ורבייה זו מקובלת לחקור ניתוחים מבניים, פונקציונליים, מולקולריים ותעתיקומיים בחקר התפתחות הלב, מחלות, והקרנה פרמקולוגית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

היכולת לחקור את התפתחות הלב האנושי בבריאות ובמחלות מוגבלת מאוד על ידי היכולת לדגמן את המורכבות של הלב האנושי במבחנה. פיתוח פלטפורמות יעילות יותר דמויי איברים שיכולות לדגמן פנוטיפים מורכבים ב- vivo , כגון organoids ואיברים על שבב, ישפר את היכולת לחקור התפתחות הלב האנושי ומחלות. מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת אורגנוידים מורכבים מאוד של הלב האנושי (hHOs) על ידי ארגון עצמי באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והפעלה של מסלול התפתחותי צעד באמצעות מעכבי מולקולות קטנות. גופים עובריים (EBs) נוצרים בצלחת 96 באר עם בארות התקשרות עגולות, אולטרה נמוכות, המקלה על תרבות ההשעיה של מבנים בודדים.
ה- EBs עוברים בידול ל- hHOs על ידי אסטרטגיית אפנון איתות Wnt בת שלושה שלבים, הכוללת הפעלת מסלול Wnt ראשונית כדי לגרום לגורל mesoderm לב, צעד שני של עיכוב Wnt כדי ליצור שושלות לב מוחלטות, וצעד הפעלה Wnt שלישי כדי לגרום לרקמות איברים פרו-אפיקרדיאליים. שלבים אלה, המתבצעים בפורמט של 96 בארות, יעילים מאוד, ניתנים לשחזור ומייצרים כמויות גדולות של אורגנוידים לריצה. ניתוח על ידי הדמיית immunofluorescence מהיום 3 ליום 11 של בידול מגלה מפרט שדה הלב הראשון והשני ורקמות מורכבות מאוד בתוך hHOs ביום 15, כולל רקמת שריר הלב עם אזורים של cardiomyocytes פרזדורים וחדריים, כמו גם תאים פנימיים מרופדים ברקמת אנדוקרדית. האורגנוידים מציגים גם רשת כלי דם מורכבת בכל המבנה ובטנה חיצונית של רקמה אפיקרדיאלית. מנקודת מבט פונקציונלית, hHOs להכות בחוזקה ולהציג פעילות סידן נורמלית כפי שנקבע על ידי Fluo-4 הדמיה חיה. בסך הכל, פרוטוקול זה מהווה פלטפורמה מוצקה למחקרי במבחנה ברקמות לב דמויי איברים אנושיים.

כדי להשיג ארגון עצמי hHO במבחנה, שינינו ושילבנו פרוטוקולי בידול שתוארו בעבר עבור הבחנה דו-שכבתית של קרדיומיוציטים21 ותאים אפיקרדיים22 באמצעות אפננים מסלול Wnt עבור 3D אורגנוידים טרום לב16 באמצעות גורמי גדילה BMP4 ו Activin A. באמצעות לוח 96-well EB ו- hHO פרוטוקול בידול המתואר...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים לב אנושי רלוונטיים להתפתחות (hHOs) ביעילות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים על ידי ארגון עצמי. הפרוטוקול מסתמך על הפעלה רציפה של רמזים התפתחותיים ומייצר רקמות לב אנושיות מורכבות ורלוונטיות מאוד מבחינה תפקודית.

יצירת אורגנוידים של לב אנושי המורכבים בעצמם המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו ליצור מבנה תלת-ממדי מורכב הדומה מאוד ללב האנושי המתפתח בצורה חסכונית פשוטה, שניתן לשכפל על פני קווי תאים. זה מורכב פרוטוקול אחד עם שלושה שלבים של בידול, אשר מעורר את כל סוגי התאים של הלב, כולל תאים ורשת כלי דם. טכניקה זו מאפשרת לנו לדגמן מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם אנושיים ולמסך טיפולים תרופתיים יעילים.הודות לאופי התפוקה הגבוה של העיצוב שלה. שיטה זו שימושית לחקירת הלב האנושי המתפתח, כמו גם מחלות הקשורות אליו בדרך כלל. אחד מהם הוא מומים מולדים בלב.פרוטוקול זה דורש מיומנויות בסיסיות של תרבית תאים. אנו ממליצים על צנרת קשובה ועדינה, כמו גם טיפול עדין באורגנוידים. התחל על ידי יצירת גופים עובריים או EBs יומיים לפני בידול.לשטוף HPSCs תת-מפגש עם DBPS למשך 10 שניות לפחות. ואז לשאוף DPBS. הוסף מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר ACUTA והקש בעדינות על הצלחת כחמש פעמים בכל דקה במשך שלוש עד חמש דקות כדי לגרום לניתוק, תוך כדי בדיקה מתחת למיקרוסקופ.לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של PSC בינוני ותיאס Avin או תיאס כדי לעצור את התגובה. Pipette התקשורת למעלה ולמטה בבאר, פעמיים עד שלוש פעמים כדי ליצור השעיה תא אחד ולאסוף את התאים. לאחר מכן להעביר את ההשעיה תא יחיד לצינור צנטריפוגה להסתובב במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.Aspirate supernatant ולבלות מחדש את התאים במיליליטר אחד של PSC בינוני ותיאס.לדלל את התאים ב- DPBS. לספור את התאים באמצעות מונה התא או ציסטומטר hemo לדלל את התאים במדיום PSC עם תיאס לריכוז של 100, 000 תאים למיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים מדוללים לכל באר של צלחת אולטרה נמוכה תחתית עגולה 96.צנטריפוגות הלוח ב 100 פעמים G במשך שלוש דקות ודגורה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות בזהירות להסיר 50 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 200 הליבה המלטה של בינוני PSC טרי, חם ל 37 מעלות צלזיוס עבור נפח של 250 microliters לבאר. לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.הסר 166 microliters או שני שליש בינוני מצד אחד של כל באר, ולהוסיף 166 microliters של RPMI 1640 המכילים תוסף B27 ללא אינסולין, שישה 990211 לעודד מיקרומולר, 0.875 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפוגנטי עצם ארבעה ו 1.5 ננוגרם למיליליטר של Activin A.Incubate במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות להסיר 166 microliters של בינוני מצד אחד של כל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI טרי 1640 עם תוסף B27 ללא אינסולין. דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.כדי לגרום למפרט mesoderm לב ביום השני, להסיר 166 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI 1640, המכיל תוסף B27 ללא אינסולין ושלושה מיקרומולר Wnt-C59 ולהמשיך דגירה במשך 48 שעות. ביום הרביעי, להסיר 166 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI טרי 1640 עם תוסף B27 ללא אינסולין, ולאחר מכן לדגור עוד 48 שעות. ביום השישי, להסיר 166 microliters של בינוני מכל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI 1640 עם תוספת B27.עבור זה ואת כל השינויים הבאים מדיה, להשתמש תוסף B27 עם אינסולין, דגירה עוד 24 שעות. ביום השביעי, תרבות התא מוכנה לבידול מקצועי. הסר 166 מיקרוליטרים של בינוני מכל באר והוסף 166 מיקרוליטרים של RPMI 1640 טרי המכיל תוספת B27 ושלושה מיקרומולרים לעודד 99021.לאחר מכן בדגרה במשך שעה אחת, לאחר שעה אחת להסיר את הצלחת מן האינקובטור, להסיר 166 microliters של בינוני מצד אחד של כל באר ולהוסיף 166 microliters של RPMI טרי 1640 המכיל תוספת B27 להמשיך דגירה עוד 48 שעות. חזור על תהליך זה כל 48 שעות עד איסוף. Organoids מוכנים ניתוחים וניסויים ביום 15 כדי להעביר את האורגנוידים כולו, לחתוך את הקצה של פיפטה P200, חמישה עד 10 מילימטרים מהפתח עם קוטר של כשני עד שלושה מילימטרים.לחץ על בוכנה pipette ולהכניס את הקצה אנכית לתוך התחתית העגולה היטב עם organoid. קח בערך 100 עד 200 מיקרוליטרים של בינוני מספיק כדי לאסוף את organoids ולהעביר אותם ליעד היעד. לפני בידול EBS מופיעים כמו שחורים מסות כדוריות תהליך הבידול מתחיל ביום אפס עם הפעלת מסלול Wnt ותוספת גורם גדילה בדיוק 24 שעות.בהמשך העריכה של Wnt C59 ביום השני גורמת להגדלת האורגנויד מכ-200 מיקרומטר למקסימום של מילימטר אחד. האורגנוידים של הלב האנושי החלו לפעום כבר ביום השישי ו-100% מהאורגנואידים הראו מכות נראות לעין ביום העשירי. תמונות הגדלה גבוהה של אורגנויד יום שביעי גילו כי רוב היד אחת מבטאת תאים היו cardiomyocyte במקור ויד שתיים היו תאים שאינם myosite מן שדה הלב השני, תאי האב.תמלילי RNA הן ביד אחת והן ביד השנייה באו לידי ביטוי מהיום השלישי ואילך בנתוני ריצוף הרנ"א. סמני ה- FHF התבטאו מאוד בימים 3 ו -11 בעוד סמן SF בא לידי ביטוי גבוה יותר לאחר היום ה -13. כתם אימונופלואורסצנטיות חשף את נוכחותן של שושלות שונות מסוג תאי הלב האנושיים המרכיבות את הלב האנושי.כגון רקמת שריר הלב והאפיקרדיה, תאי אנדוקרדיים, תאי אנדותל ופיברובלסט לבבי. הסמנים המבטאים את שושלות התאים לעיל נצפו גם בפרופילי ביטוי הגנים RNA SAC. הדמיית סידן חיה של תאים בודדים באורגנוידים שלמים שימשה למדידת התפקוד האלקטרופיזיולוגי של האורגנוידים.עוצמת הפלואורסצנטיות של Fluo-4 השתנתה עם הזמן עקב יציאת כניסת סידן מהתא החושפת פוטנציאל פעולה קבוע. מפות חום המציגות עוצמות סידן מעל אזור הגדלה גבוה של האורגנויד, מראות עוצמה מוגברת עקב סידן ארעי ותאים בודדים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי EBs ו organoids הבאים אינם מחוברים לתחתית הצלחת, ואנו לנוע עם ההסרה בנוסף מדיה הדורשת שינויים תקשורתיים קשובים.Organoids יכול להיות תרבות לתקופות זמן ארוכות יותר הציג טכניקות התבגרות, או אפילו חשוף לגירויים חיצוניים, כגון מיזוג מכני או חשמלי, ואפילו גורמי לחץ כגון רעלים. טכניקה זו מאפשרת גישה לשלבים של התפתחות הלב העוברי האנושי שאינם נגישים אחרת במחקר, וסוללת את הדרך לתובנות חדשות על התפתחות הלב ואטיולוגיה של מחלות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

עיבוד תאי גזע מזנכימליים אנושיים ליישומים קליניים באמצעות זרימת עבודה סגורה חצי אוטומטית

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...