Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health con i numeri di premio K01HL135464 e R01HL151505 e dall'American Heart Association con il numero di premio 19IPLOI34660342. Desideriamo ringraziare il MSU Advanced Microscopy Core e il Dr. William Jackson presso il Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia della MSU per l'accesso ai microscopi confocali, al Nucleo di Microscopia QI e al Nucleo di Genomica MSU per i servizi di sequenziamento. Desideriamo anche ringraziare tutti i membri dell'Aguirre Lab per i loro preziosi commenti e consigli.

1. Coltura e manutenzione hPSC
NOTA: Le PSC indotte dall'uomo (hiPSC) o le cellule staminali embrionali umane (hESC) devono essere coltivate per almeno 2 passaggi consecutivi dopo lo scongelamento prima di essere utilizzate per generare EB per differenziazione o ulteriore crioconservazione. Le hPSC sono coltivate in terreno PSC (vedi tabella dei materiali) su piastre di coltura a 6 pozzetti rivestite con membrana basale (BM-ECM). Quando si eseguono cambiamenti del mezzo sulle hP...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

I recenti progressi nei cardiomiociti derivati da cellule staminali umane e in altre cellule di origine cardiaca sono stati utilizzati per modellare lo sviluppo del cuore umano22,24,25 e la malattia26,27,28 e come strumenti per lo screening di terapie29,30 e agenti <sup class="...

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto congenito nell'uomo e colpiscono circa l'1% di tutti i nati vivi1,2,3. Nella maggior parte dei casi, le ragioni dei CHD rimangono sconosciute. La capacità di creare modelli di cuore umano in laboratorio che assomigliano molto al cuore umano in via di sviluppo costituisce un significativo passo avanti per studiare direttamente le cause alla base dei CHD negli esseri umani piuttosto che in modelli animali surrogati.
L'epitome dei modelli tissutali cresciuti in laboratorio sono gli organoidi, costrutti cellulari 3D che assomigliano a un organo di interesse per la composizione cellulare e la funzione fisiologica. Gli organoidi sono spesso derivati da cellule staminali o cellule progenitrici e sono stati utilizzati con successo per modellare molti organi come il cervello4,5, il rene6,7, l'intestino8,9, il polmone10,11, il fegato12,13 e il pancreas14,15 , solo per citarne alcuni. Recenti studi sono emersi dimostrando la fattibilità della creazione di organoidi cardiaci auto-assemblanti per studiare lo sviluppo del cuore in vitro. Questi modelli includono l'utilizzo di cellule staminali embrionali di topo (mESC) per modellare lo sviluppo cardiaco precoce16,17 fino alla specifica atrioventricolare18 e cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) per generare organoidi cardiaco-endodermici multi-strato germinale19 e cardioidi camerati20 con composizione cellulare altamente complessa.
Questo documento presenta un nuovo protocollo di modulazione WNT in 3 fasi per generare hHO altamente complessi in modo efficiente ed economico. Gli organoidi sono generati in piastre a 96 pozzetti, risultando in un sistema scalabile e ad alta produttività che può essere facilmente automatizzato. Questo metodo si basa sulla creazione di aggregati hPSC e sull'innesco di fasi di sviluppo della cardiogenesi, tra cui la formazione di mesoderma e mesoderma cardiaco, la specifica del primo e del secondo campo cardiaco, la formazione di organi proepiardici e la specifica atrioventricolare. Dopo 15 giorni di differenziazione, gli hHO contengono tutte le principali linee cellulari presenti nel cuore, camere interne ben definite, camere atriali e ventricolari e una rete vascolare in tutto l'organoide. Questo sistema organoide cardiaco altamente sofisticato e riproducibile è in grado di studiare analisi strutturali, funzionali, molecolari e trascrittomiche nello studio dello sviluppo cardiaco e delle malattie e dello screening farmacologico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

La capacità di studiare lo sviluppo cardiaco umano in salute e malattia è fortemente limitata dalla capacità di modellare la complessità del cuore umano in vitro. Lo sviluppo di piattaforme simili a organi più efficienti in grado di modellare fenotipi complessi in vivo , come organoidi e organi su chip, migliorerà la capacità di studiare lo sviluppo e le malattie del cuore umano. Questo documento descrive un protocollo per generare organoidi cardiaci umani (hHO) altamente complessi mediante auto-organizzazione utilizzando cellule staminali pluripotenti umane e attivazione graduale del percorso di sviluppo utilizzando inibitori di piccole molecole. I corpi embrioidi (EB) sono generati in una piastra a 96 pozzetti con fondo tondo e pozzi di attacco ultra-bassi, facilitando la coltura in sospensione di costrutti individualizzati.
Gli EB subiscono la differenziazione in hHO mediante una strategia di modulazione del segnale Wnt in tre fasi, che prevede un'attivazione iniziale della via Wnt per indurre il destino del mesoderma cardiaco, una seconda fase di inibizione Wnt per creare linee cardiache definitive e una terza fase di attivazione Wnt per indurre tessuti d'organo proepiardici. Questi passaggi, eseguiti in un formato a 96 pozzetti, sono altamente efficienti, riproducibili e producono grandi quantità di organoidi per corsa. L'analisi mediante imaging a immunofluorescenza dal giorno 3 al giorno 11 della differenziazione rivela le specifiche del primo e del secondo campo cardiaco e tessuti altamente complessi all'interno degli hHO al giorno 15, incluso il tessuto miocardico con regioni di cardiomiociti atriali e ventricolari, nonché camere interne rivestite di tessuto endocardico. Gli organoidi presentano anche un'intricata rete vascolare in tutta la struttura e un rivestimento esterno di tessuto epicardico. Da un punto di vista funzionale, gli hHO battono in modo robusto e presentano una normale attività del calcio come determinato dall'imaging dal vivo Fluo-4. Nel complesso, questo protocollo costituisce una solida piattaforma per studi in vitro in tessuti cardiaci simili a organi umani.

Per ottenere hHO auto-organizzante in vitro, abbiamo modificato e combinato i protocolli di differenziazione precedentemente descritti per la differenziazione monostrato 2D di cardiomiociti21 e cellule epicardiche22 utilizzando modulatori di pathway Wnt e per organoidi precardiac 3D16 utilizzando i fattori di crescita BMP4 e Activin A. Utilizzando il protocollo di differenziazione EB e hHO a piastre a 96 pozzetti descritto qui e mostrato nel...

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Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Qui, descriviamo un protocollo per creare organoidi cardiaci umani rilevanti per lo sviluppo (hHO) in modo efficiente utilizzando cellule staminali pluripotenti umane mediante auto-organizzazione. Il protocollo si basa sull'attivazione sequenziale dei segnali di sviluppo e produce tessuti cardiaci umani altamente complessi e funzionalmente rilevanti.

Generazione di organoidi cardiaci umani auto-assemblanti derivati da cellule staminali pluripotenti

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Questo protocollo ci consente di creare una complessa struttura 3D che ricorda da vicino il cuore umano in via di sviluppo in un modo semplice ed economico, che è riproducibile attraverso le linee cellulari. Consiste in un unico protocollo con tre fasi di differenziazione, che dà origine a tutti i tipi di cellule del cuore, comprese le camere e una rete vascolare. Questa tecnica ci consente di modellare una vasta gamma di malattie cardiovascolari umane e di selezionare trattamenti farmacologici efficaci.Grazie alla natura ad alta produttività del suo design. Questo metodo è utile per studiare il cuore umano in via di sviluppo e le malattie comunemente associate ad esso. Uno di questi sono difetti cardiaci congeniti.Questo protocollo richiede competenze di base per la coltura cellulare. Raccomandiamo un pipettaggio attento e delicato e una manipolazione delicata degli organoidi. Inizia creando corpi embrioidi o EB due giorni prima della differenziazione.Lavare HPSC subconfluenti con DBPS per almeno 10 secondi. Quindi aspirare il DPBS. Aggiungere un millilitro di ACUTA a temperatura ambiente e picchiettare delicatamente la piastra circa cinque volte al minuto per tre-cinque minuti per indurre il distacco, controllando al microscopio.Quindi aggiungere un millilitro di mezzo PSC e Thias Avin o Thias per fermare la reazione. Pipettare il mezzo su e giù nel pozzo, due o tre volte per generare una singola sospensione cellulare e raccogliere le cellule. Quindi trasferire la sospensione a cella singola in un tubo centrifuga e girare per cinque minuti a 300 volte G.Aspirare il surnatante e ri-spendere le cellule in un millilitro di mezzo PSC e Thias.Diluire le cellule in DPBS. Contare le cellule usando un contatore cellulare o un cistometro emodale e diluire le cellule in mezzo PSC con Thias ad una concentrazione di 100.000 cellule per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di sospensione di celle diluite a ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo ultra basso da 96 pozzetti.Centrifugare la piastra a 100 volte G per tre minuti e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore rimuovere con cura 50 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 200 cucciolate di terreno PSC fresco, caldo a 37 gradi Celsius per un volume di 250 microlitri per pozzetto. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Rimuovere 166 microlitri o due terzi del mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 contenenti integratore B27 senza insulina, sei 990211 di allegria micromolare, 0,875 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea quattro e 1,5 nanogrammi per millilitro di Activin A.Incubate per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore rimuovere 166 microlitri di mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco con supplemento di B27 senza insulina. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Per indurre la specifica del mesoderma cardiaco il secondo giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640, contenenti integratore B27 senza insulina e tre micromolari Wnt-C59 e continuare l'incubazione per 48 ore. Il quarto giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco con integratore di B27 senza insulina, quindi incubare altre 48 ore. Il sesto giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzo e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 con supplemento B27.Per questo e tutti i successivi cambiamenti dei media, utilizzare il supplemento B27 con insulina, incubare per altre 24 ore. Il settimo giorno, la coltura cellulare è pronta per la differenziazione pro epicardica. Rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco contenente supplemento B27 e tre cheer micromolari 99021.Quindi in incubazione per un'ora, dopo un'ora rimuovere la piastra dall'incubatore, rimuovere 166 microlitri di mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco contenente integratore B27 continuare l'incubazione per altre 48 ore. Ripeti questo processo ogni 48 ore fino al ritiro. Gli organoidi sono pronti per analisi e sperimentazioni il giorno 15 Per trasferire l'intero organoide, tagliare la punta di una pipetta P200, da cinque a 10 millimetri dall'apertura con un diametro di circa due o tre millimetri.Premere lo stantuffo della pipetta e inserire la punta verticalmente nel pozzetto del fondo rotondo con l'organoide. Assorbire circa 100-200 microlitri di mezzo sufficiente per raccogliere gli organoidi e trasferirli alla destinazione target. Prima che gli EBS di differenziazione appaiano come masse sferiche nere, il processo di differenziazione inizia il giorno zero con l'attivazione di un percorso Wnt e l'aggiunta del fattore di crescita per esattamente 24 ore.Inoltre la modifica di Wnt C59 il secondo giorno comporta l'allargamento dell'organoide da circa 200 micrometri a un massimo di un millimetro. Gli organoidi cardiaci umani hanno iniziato a battere già il sesto giorno e il 100% degli organoidi ha mostrato un battito visibile entro il giorno 10. Le immagini ad alto ingrandimento dell'organoide del settimo giorno hanno rivelato che la maggior parte delle cellule che esprimono la mano uno erano cardiomiociti in origine e la mano due erano cellule non miosite dal secondo Heartfield, cellule progenitrici.I trascritti di RNA sia per la mano uno che per la mano due sono stati espressi dal terzo giorno in poi nei dati di sequenziamento dell'RNA. I marcatori FHF sono stati altamente espressi durante i giorni tre e 11 mentre il marcatore SF è stato più altamente espresso dopo il giorno 13. La colorazione di immunofluorescenza ha rivelato la presenza di vari lignaggi di cellule cardiache umane che compongono il cuore umano.Come il tessuto miocardico ed epicardico, le cellule endocardiche, le cellule endoteliali e i fibroblasti cardiaci. I marcatori che esprimono le linee cellulari di cui sopra sono stati osservati anche nei profili di espressione genica dell'RNA SAC. L'imaging del calcio vivo di singole cellule in organoidi interi è stato utilizzato per misurare la funzione elettrofisiologica degli organoidi.L'intensità di fluorescenza del fluo-4 variava nel tempo a causa dell'uscita di ingresso del calcio dalla cellula che rivela potenziali d'azione regolari. Le mappe di calore che mostrano le intensità di calcio su una regione ad alto ingrandimento dell'organoide, mostrano una maggiore intensità dovuta ai transitori di calcio e alle singole cellule. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che gli EB e gli organoidi successivi non sono attaccati al fondo della piastra e ci sposteremo con la rimozione oltre ai supporti che richiedono modifiche attente ai supporti.Gli organoidi possono essere coltivati per periodi di tempo più lunghi introdotti alle tecniche di maturazione, o anche esposti a stimoli esterni, come il condizionamento meccanico o elettrico, e persino fattori di stress come le tossine. Questa tecnica consente l'accesso a stadi di sviluppo del cuore fetale umano che sono altrimenti inaccessibili nella ricerca, aprendo la strada a nuove intuizioni sullo sviluppo del cuore e sull'eziologia della malattia.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

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Deplezione extracellulare di glucosio come misura indiretta dell'assorbimento di glucosio nelle cellule e nei tessuti Ex Vivo

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Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Elaborazione di cellule staminali mesenchimali umane per applicazioni cliniche utilizzando un flusso di lavoro semi-automatizzato chiuso

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...