Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464とR01HL151505の下で、および賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされました。MSU薬理毒性学科のMSUアドバンスト顕微鏡コアとウィリアム・ジャクソン博士は、コンフォーカル顕微鏡、IQ顕微鏡コア、シーケンシングサービスのためのMSUゲノミクスコアへのアクセスに感謝したいと思います。また、アギーレラボのメンバーの皆様の貴重なコメントやアドバイスに感謝申し上げたいと思います。

1. hPSCの文化とメンテナンス
注:ヒト誘導PSC(hiPSC)またはヒト胚性幹細胞(hESC)は、分化またはさらなる凍結保存のためにEBを生成するために使用される前に、解凍後に少なくとも2回連続した通路のために培養する必要があります。hPSCは、基質膜外細胞マトリックス(BM-ECM)コーティングされた6ウェル培養プレート上のPSC培地( 材料表参照)で培養される。6ウェルプレ...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

ヒト幹細胞由来心筋細胞および心臓由来の他の細胞の最近の進歩は、ヒト心臓の発達22,24,25および疾患26,27,28をモデル化し、治療をスクリーニングするためのツールとして使用されています29,30および有毒物質31,32<...

先天性心不全(CHD)は、ヒトにおける先天性欠損の最も一般的なタイプであり、全ての出生の約1%に影響を及ぼす1,2,3。ほとんどの場合、CHD の理由は不明のままです。開発中の人間の心臓に近いヒトの心臓モデルを実験室で作成する能力は、代理動物モデルではなく、ヒトにおけるCHDの根本的な原因を直接研究するための重要な前進を構成する。
実験室で成長した組織モデルの縮図は、細胞組成および生理機能に関心のある器官に似たオルガノイド、3D細胞構築物である。オルガノイドは幹細胞や前駆細胞に由来することが多く、脳4,5、腎臓6、7、腸8、9、肺10、11、肝臓12,13、膵臓などの多くの臓器のモデル化に成功しています14,15、ちょうどいくつかの名前を付けるために。最近の研究は、体外で心臓の発達を研究するために自己集合性心臓オルガノイドを作成する実現可能性を実証することが明らかになってきました。これらのモデルには、マウス胚性幹細胞(mESC)を使用して、房室仕様18までの初期心臓発達16,17、ヒト多能性幹細胞(hPSC)をモデル化し、多発層心内膜オルガノイド19および非常に複雑な細胞組成を有するチャンバードカーディオイド20を生成することを含む。
本論文は、高い複雑なhHOsを効率的かつ費用対効果の高い方法で生成するための、新しい3段階のWNT変調プロトコルを紹介する。オルガノイドは96ウェルプレートで生成され、容易に自動化できるスケーラブルでハイスループットなシステムをもたらします。この方法は、中皮および心中皮形成、第1および第2の心臓フィールド仕様、前EPICAR器官形成、および房室仕様を含む、hPSC凝集体を作成し、心新生の発達段階を引き起こすことに依存する。分化の15日後、hhOsは、心臓に見られるすべての主要な細胞系統、明確に定義された内部チャンバー、心房および心室室、およびオルガノイド全体の血管ネットワークを含む。この高度で再現性の高い心臓オルガノイドシステムは、心臓の発達、疾患、薬理学的スクリーニングの研究において、構造的、機能的、分子的、および転写学的分析を調査するのに適しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

健康と病気におけるヒト心臓の発達を研究する能力は、 インビトロでのヒト心臓の複雑さをモデル化する能力によって非常に制限される。オルガノイドやオルガンオンチップなどの複雑な 生体内 表現型をモデル化できる、より効率的な臓器のようなプラットフォームを開発することは、人間の心臓の発達と病気を研究する能力を高めるでしょう。本論文では、ヒト多能性幹細胞を用いた自己組織化と、低分子阻害剤を用いた段階的発達経路活性化により、非常に複雑なヒト心臓オルガノイド(hH)を生成するプロトコルについて述べている。胚体(EBs)は、ラウンドボトム、超低付着ウェルを備えた96ウェルプレートで生成され、個別の構築物の懸濁培養を促進します。
EBsは、心臓中皮運命を誘導するための最初のWnt経路活性化、決定的な心臓系統を作成するためのWnt阻害の第2ステップ、および前EPICAR組織を誘導する第3のWnt活性化ステップを含む3段階のWntシグナル伝達変調戦略によってhHOsへの分化を受ける。これらのステップは、96ウェル形式で行われ、非常に効率的で再現性が高く、1回の実行ごとに大量のオルガノイドを生成します。分化の3日目から11日目までの免疫蛍光イメージングによる分析は、心房および心室心筋細胞の領域を有する心筋組織および内腔内の内膜組織を含む、15日目のhHOs内の第1および第2の心臓フィールド仕様および非常に複雑な組織を明らかにする。オルガノイドはまた、構造全体に複雑な血管ネットワークを示し、外膜組織の外部内層を示す。機能的な観点から、hHOsは強く打ち負かし、Fluo-4ライブイメージングによって決定される正常なカルシウム活性を示す。全体として、このプロトコルは、ヒト臓器様心臓組織 におけるインビトロ 研究のための強固なプラットフォームを構成する。

インビトロで自己組織化hHOを達成するために、我々は、Wnt経路モジュレーターを使用した心筋細胞21および心外細胞22の2D単層分化および成長因子BMP4およびアクチビンAを用いた3D前心臓オルガノイド16に関して以前に説明した分化プロトコルを修正し、組み合わせた図Wnt経路活性化因子CHIR99021の濃度と曝露期間?...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

このプロトコルは、細胞株を越えて再現可能な、簡単な費用対効果の高い方法で発達中の人間の心臓に近い複雑な3D構造を作成することを可能にします。これは、チャンバーや血管ネットワークを含む心臓のすべての細胞タイプを生じさせる分化の3つのステップを持つ単一のプロトコルで構成されています。この技術は、広範囲のヒト心血管疾患をモデル化し、効果的な薬理学的治療法をスクリーニングすることを可能にする。その設計の高いスループットの性質のおかげで。この方法は、発達中のヒト心臓およびそれに一般的に関連する疾患を調査するのに有用である。そのうちの一つは先天性心不全です。このプロトコルには、基本的な細胞培養能力が必要です。オルガノイドの取り扱いだけでなく、気配りや繊細なピペットをお勧めします。最初に、分化の2日前に胚体またはEJBを作成します。DBPS を使用してサブコンフルエント HPCs を少なくとも 10 秒間洗浄します。その後、DPBSを吸引します。室温ACUTAを1ミリリットル加え、顕微鏡下でチェックしながら、剥離を誘発するために3〜5分間、毎分約5回プレートを軽くタップします。その後、PSC培地とチアス・アビンまたはティアスを1ミリリットル加えて反応を止めます。ウェル内のメディアを上下にピペットし、2〜3回、単一の細胞懸濁液を生成し、細胞を収集する。その後、単一細胞懸濁液を遠心分離管に移し、上清を吸引し、PSC培地とチアスの1ミリリットルで細胞を再使用して300倍G.吸引して5分間回転させます。DPBSで細胞を希釈します。細胞カウンターまたはヘモシストメーターを使用して細胞を数え、PSC培地中の細胞をチアスで1ミリリットル当たり100,000細胞の濃度に希釈する。希釈した細胞の100マイクロリットルを、丸底超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに懸濁液を加える。プレートを100倍Gで3分間遠心し、摂氏37度と炭酸ガス5%で24時間インキュベートする。24時間後、慎重に各井戸から媒体の50マイクロリットルを除去し、新鮮なPSC媒体の200コアのごみを追加し、井戸あたり250マイクロリットルの体積のために摂氏37度に暖めます。セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で24時間インキュベートします。各ウェルの片側から166マイクロリットルまたは2分の2の培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントを含むRPMI 1640の166マイクロリットル、6マイクロモルモルチア990211、骨モルモジェネティックタンパク質4の1ミリリットル当たり0.875ナノグラム、ActivA.Incubateあたり1ミリリットル当たり1.5ナノグラムを37°Cで24時間取り出します。24時間後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。2日目に心臓中皮の仕様を誘導するには、各ウェルから166マイクロリットルの培地を取り除き、166マイクロリットルのRPMI 1640を加え、インスリンフリーB27サプリメントと3つのマイクロモルWnt-C59を含み、48時間インキュベートを続けます。4日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、インスリンフリーB27サプリメントで新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートします。6日目には、各井戸から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントでRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。これとすべてのその後のメディアの変更のために、 インスリンで B27 サプリメントを使用して、さらに 24 時間インキュベート.7日目に、細胞培養は、プロ心筋分化の準備ができている。各井戸から166マイクロリットルの培地を取り出し、B27サプリメントと3つのマイクロモルチア99021を含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加します。その後、1時間インキュベートで、インキュベーターからプレートを1時間取り出した後、各ウェルの片側から166マイクロリットルの培地を取り除き、B27サプリメントを含む新鮮なRPMI 1640の166マイクロリットルを追加し、さらに48時間インキュベートを続けます。収集まで48時間ごとにこのプロセスを繰り返します。オルガノイドは15日目に分析と実験の準備ができているオルガノイド全体を移送し、P200ピペットの先端を切り取り、直径約2〜3ミリメートルの開口部から5〜10ミリメートル。ピペットプランジャーを押し、オルガノイドと一緒に丸底ウェルに垂直にチップを挿入します。オルガノイドを収集し、ターゲット先に転送するのに十分な媒体の約100〜200マイクロリットルを取ります。分化 EBS が黒球形の質量として出現する前に、分化プロセスは、ちょうど 24 時間の Wnt 経路活性化と成長因子の追加でゼロ日目に開始されます。さらに2日目にWnt C59を編集すると、オルガノイドは約200マイクロメートルから最大1ミリメートルに拡大されます。ヒト心臓オルガノイドは早ければ6日目に鼓動を始め、オルガノイドの100%は10日目までに目に見える拍動を示した。7日目のオルガノイドの高倍率画像は、ほとんどの手1発現細胞が起源の心筋細胞であり、手2が第2のハートフィールド、前駆細胞からの非筋細胞であることを明らかにした。手1と手の両方のRNA転写物は、RNAシーケンシングデータで3日目以降に発現した。FHFマーカーは3日目と11日目に高く発現し、SFマーカーは13日目以降より高く発現した。免疫蛍光染色は、ヒトの心臓を構成する様々なヒト心臓細胞型系統の存在を明らかにした。心筋および心外膜組織、心筋細胞、内皮細胞、および心臓線維芽細胞など。上記の細胞系統を発現するマーカーは、RNA SAC遺伝子発現プロファイルにおいても観察された。オルガノイドの個々の細胞の生きたカルシウムイメージングは、オルガノイドの電気生理学的機能を測定するために使用された。Fluo-4蛍光強度は、定期的な作用電位を明らかにする細胞からのカルシウム入り口出口のために時間の経過とともに変化した。オルガノイドの高倍率領域にわたってカルシウム強度を示すヒートマップは、カルシウム過渡量および個々の細胞による強度の増加を示す。このプロトコルを試みるとき、EBおよびそれに続くオルガノイドはプレートの底に取り付けられていないことを覚えておいてください、そして我々は注意深い媒体の変更を必要とする媒体の他に取り外しと動き回る。オルガノイドは、成熟技術に導入された長期間培養したり、機械的または電気的コンディショニングなどの外部刺激にさらされたり、毒素などのストレッサーにさらされたりすることさえできます。この技術は、研究ではアクセスできないヒト胎児心臓発達の段階へのアクセスを可能にし、心臓の発達と病因に関する新しい洞察への道を開く。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

クローズド半自動ワークフローを用いた臨床応用のためのヒト間葉系幹細胞処理

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...