Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

이 작품은 수여 번호 K01HL135464 및 R01HL151505 및 수상 번호 19IPLOI34660342에서 미국 심장 협회에 의해 국립 건강 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 MSU 고급 현미경 검사법과 공초점 현미경, IQ 현미경 코어 및 시퀀싱 서비스에 대한 MSU 유전체학 코어에 대한 액세스에 대한 약리학 및 독성학의 MSU 부서에서 박사 윌리엄 잭슨에게 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 귀중한 의견과 조언에 대한 Aguirre 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다.

1. hPSC 문화 및 유지 보수
참고: 인간 유도 된 PSC (hiPSCs) 또는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)는 분화 또는 추가 극저온 보존을 위해 EB를 생성하는 데 사용되기 전에 해동 후 적어도 2 개의 연속 된 구절을 배양해야합니다. hPSC는 지하 막 세포 매트릭스 (BM-ECM)-코팅 된 6 웰 배양 판에 PSC 배지 ( 재료의 표 참조)에서 배양된다. 6웰 플레이트에서 hPSC에 대한 중간 변화를 수행할 ?...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

최근 인간 줄기세포 유래 심근세포 및 심장 기원의 다른 세포에서 의기유는 인간 심장 발달을 모델링하는 데 사용되어 왔으며, 26,27,28및 치료학적 29,30및 독성제를 선별하는 도구로 사용되었습니다3...

선천성 심장 결함 (CHDs)은 인간에 있는 선천적인 결함의 일반적인 모형이고 모든 살아있는 출생의 대략 1%에 영향을 미칩니다1,2,3. 대부분의 상황에서 CHD의 이유는 아직 알려지지 않았습니다. 발달하는 인간 심장과 밀접하게 유사한 실험실에서 인간 심장 모델을 만드는 능력은 대리 동물 모델보다는 인간에서 CHDs의 근본 원인을 직접 연구하는 중요한 단계를 구성합니다.
실험실에서 자란 조직 모델의 전형은 세포 조성 및 생리 기능에 대한 관심기관과 유사한 오르가노이드, 3D 세포 구조입니다. 오르가노이드는 종종 줄기 세포 또는 전구 세포에서 파생되며 성공적으로 뇌4,5, 신장6,7, 장8,9, lung10,11, liver12,13 및 췌장14,15와 같은 많은 장기를 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. , 그냥 몇 가지 이름을 지정합니다. 최근 연구는 체외에서 심장 발달을 연구하기 위해 자기 조립 심장 오르가노이드를 만드는 타당성을 입증 등장했다. 이러한 모델은 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)를 사용하여 초기 심장 발달을 모델링16,17 최대 대상반성 사양18 및 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)를 사용하여 다발성 층 심장 엔데데름 오르노이드19 및 매우 복잡한 세포 구성을 가진 챔버 심장 근막 20을 생성합니다.
이 논문은 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 매우 복잡한 hHOS를 생성하는 새로운 3 단계 WNT 변조 프로토콜을 제공합니다. 오가노이드는 96웰 플레이트에서 생성되어 쉽게 자동화할 수 있는 확장 가능한 고처리량 시스템을 생성합니다. 이 방법은 hPSC 골재를 생성하고 심근 및 심장 중구 형성, 제 1 및 두 번째 심장 필드 사양, 미상동맥 기관 형성 및 대상 동맥 사양을 포함한 심장 발생의 발달 단계를 유발하는 데 의존합니다. 분화 후, hHOs는 심장에서 발견 되는 모든 주요 세포 혈통을 포함, 잘 정의 된 내부 챔버, 심방 및 심실 챔버, 그리고 오르가노이드 에 걸쳐 혈관 네트워크. 이 매우 정교하고 재현 가능한 심장 오르가노이드 시스템은 심장 발달, 질병 및 약리학적 스크리닝의 연구에서 구조적, 기능적, 분자 및 전사 적 분석을 조사할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

건강과 질병에서 인간의 심장 발달을 연구하는 능력은 체외에서 인간의 심장의 복잡성을 모델링하는 능력에 의해 매우 제한됩니다. 오르가노이드 및 장기 온 칩과 같은 생체 내 표현형에서 복합체를 모델링할 수 있는 보다 효율적인 장기 와 같은 플랫폼을 개발하면 인간의 심장 발달과 질병을 연구하는 능력이 향상됩니다. 이 논문은 인간 만능 줄기 세포를 사용하여 자기 조직에 의해 매우 복잡한 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 생성하고 작은 분자 억제제를 사용하여 단계별 발달 경로 활성화를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 배아 체(EB)는 둥근 바닥, 초저 부착 우물이 있는 96웰 플레이트에서 생성되어 개별화된 구조의 현탁액 배양을 용이하게 합니다.
EB는 심장 중피 운명을 유도하기 위한 초기 Wnt 통로 활성화, 결정적인 심장 혈통을 만들기 위한 Wnt 억제의 두 번째 단계, 그리고 미원성 장기 조직을 유도하는 세 번째 Wnt 활성화 단계를 포함하는 3단계 Wnt 신호 변조 전략에 의해 hHOs로 분화를 거칩니다. 96웰 형식으로 수행되는 이 단계는 매우 효율적이고 재현 가능하며 실행당 다량의 오르가노이드를 생성합니다. 3일부터 11일까지 11일째에 면역형광 영상에 의한 분석은 심방 및 심실 심근세포의 영역을 가진 심근 조직뿐만 아니라 내시경 조직으로 늘어선 내부 챔버를 포함하여 15일째에 hHOs 내부의 첫 번째 및 두 번째 심장 장 사양 및 매우 복잡한 조직을 보여줍니다. 오르가노이드는 또한 구조 전반에 걸쳐 복잡한 혈관 네트워크와 상피 조직의 외부 안대기를 나타낸다. 기능적 관점에서 hHSo는 플루오-4 라이브 이미징에 의해 결정된 정상 칼슘 활성을 견고하게 이길 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 장기 같이 심장 조직에 있는 체외 연구를 위한 단단한 플랫폼을 구성합니다.

시험관 내 자가 조직 hHO를 달성하기 위해, 우리는 이전에 Wnt 통로 변조기를 사용하여 심근 세포21 및 상복부 세포의 2D 단층 분화에 대해 설명된 2D 단층 분화 프로토콜을 수정하고 결합하고 성장 인자 BMP4 및 Activin A. 96 웰 플레이트 EB 및 hHOi 프로토콜을 사용하여 여기에 설명된 피규어 1을 사용하여 설명된 피규어 1 ,...

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Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

이 프로토콜을 사용하면 세포주 전체에서 재현 가능한 간단한 비용 효율적인 방법으로 발달하는 인간의 심장과 밀접하게 유사한 복잡한 3D 구조를 만들 수 있습니다. 그것은 분화의 3 단계를 가진 단일 프로토콜로 구성, 이는 심장의 모든 세포 유형을 초래, 챔버와 혈관 네트워크를 포함. 이 기술은 우리가 인간의 심장 혈관 질병의 넓은 범위를 모델링하고 효과적인 약리학적 치료를 선별 할 수 있습니다.디자인의 높은 처리량 특성 덕분에. 이 방법은 일반적으로 그와 관련된 질병뿐만 아니라 개발 인간의 심장을 조사하는 데 유용합니다. 그 중 하나는 선천성 심장 결함입니다.이 프로토콜에는 기본적인 세포 배양 기술이 필요합니다. 우리는 오가노이드의 세심하고 섬세한 피펫팅뿐만 아니라 부드러운 취급을 권장합니다. 분화 이틀 전에 배아 체 나 EB를 만드는 것으로 시작합니다.DBPS로 서브컨블아웃 HPSC를 10초 이상 세척합니다. 그런 다음 DPBS를 흡인합니다. 실온 ACUTA의 1 밀리리터를 추가하고 현미경으로 확인하는 동안 분리를 유도하기 위해 3~5분 동안 매 분당 약 5회 접시를 부드럽게 누릅니다.그런 다음 PSC 배지와 티아스 아빈 또는 티아스 1 밀리리터를 추가하여 반응을 중지합니다. 파이펫은 미디어를 우물에서 위아래로, 2~3회 하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 세포를 수집한다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 300회 G.에서 5분간 회전하여 슈퍼나탈을 흡인하고 PSC 배지 및 티아스 1밀리리터로 세포를 다시 소비한다.DPBS의 세포를 희석시. 세포 카운터 또는 헤모 낭포계를 사용하여 세포를 계산하고 밀리리터 당 100, 000 세포의 농도로 티아스와 PSC 배지에서 세포를 희석. 희석 된 셀 현탁액 100 마이크로 리터를 둥근 바닥 초저 부착 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.플레이트를 3분 동안 100배G로 원심분리하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후 조심스럽게 각 우물에서 50 마이크로리터의 마이크로리터를 제거하고 200 개의 신선한 PSC 매체를 추가하여 섭씨 37도까지 따뜻하게 하여 웰당 250 마이크로리터의 부피를 제공합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.각 우물의 한쪽에서 166 마이크로리터 또는 매질의 2/3을 제거하고, 인슐린 무료 B27 보충제를 함유한 RPMI 1640의 마이크로리터 166편, 990211 6개, 체형 유전자 단백질 의 밀리리터 당 0.875 나노그램, 액티비틴 A.Incubate 의 밀리리터 당 1.5 나노그램을 24%의 섭씨 57%에서 제거합니다. 후 24 6 각 우물의 한쪽에서 매체의 마이크로 리터166 마이크로 리터를 추가 하 고 추가 166 신선한 RPMI의 마이크로 리터 1640 인슐린 무료 B27 보충. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양하세요.둘째 날에 심장 중피 사양을 유도하기 위해 각 우물에서 166 마이크로리터를 제거하고 RPMI 1640의 166 마이크로리터를 추가하여 인슐린 무료 B27 보충제와 3개의 마이크로몰러 Wnt-C59를 함유하고 48시간 동안 배양을 계속합니다. 4일째에, 각 우물에서 166 마이크로리터의 마이크로리터를 제거하고 인슐린 무료 B27 보충제로 신선한 RPMI 1640의 166 마이크로리터를 추가한 다음, 또 다른 48시간을 배양합니다. 6일째에는 각 우물에서 166마이크로리터의 미디온을 제거하고 B27 보충제로 RPMI 1640의 마이크로리터 166마이크로리터를 추가합니다.이 모든 후속 미디어 변화에 대 한, 사용 B27 인슐린과 보충, 다른 24 시간 동안 배양. 7일째에, 세포 배양은 프로 상근 분화를 위한 준비가 되어 있습니다. 각 우물에서 166 마이크로리터의 매체를 제거하고 B27 보충제와 3개의 마이크로몰러 응원 99021을 함유한 신선한 RPMI 1640의 마이크로리터 166마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 1 시간 동안 인큐베이션에서 1 시간 동안 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 각 우물의 한쪽에서 166 마이크로 리터를 제거하고 B27 보충제를 함유 한 신선한 RPMI 1640의 마이크로 리터 166 마이크로 리터를 추가하여 다른 48 시간 동안 인큐베이션을 계속합니다. 수집 될 때까지 48 시간마다이 과정을 반복하십시오. 오르가노이드는 15일째에 분석 및 실험을 통해 전체 오르가노이드를 옮기고, P200 파이펫의 끝을 약 2~3mm의 직경으로 개구부에서 5~10mm 로 자른다.파이펫 플런저를 누르고 오간로이드와 잘 둥근 바닥에 팁을 수직으로 삽입합니다. 오르가노이드를 수집하고 대상 대상으로 전송할 수 있을 만큼 약 100~200마이크로리터의 매체를 차지합니다. 분화 EBS가 흑인 구형 덩어리로 나타나기 전에 분화 과정은 정확히 24 시간 동안 Wnt 통로 활성화 및 성장 인자 추가로 0 일째에 시작됩니다.또한 2일째에 Wnt C59의 편집은 오르가노이드를 약 200 마이크로미터에서 최대 1mm로 확대시키는 결과를 낳습니다. 인간 심장 오르가노이드는 6일째와 100%의 오르가노이드가 10일째에 눈에 보이는 박동을 보였기 때문에 일찍 부터 뛰기 시작했습니다. 7일째 의 높은 배율 이미지는 대부분의 손 발현 세포가 원점에서 심근세포이고 손 2개는 제2 하트필드, 선조 세포로부터 비심근세포였다는 것을 밝혔다.손 1과 손 2모두에 대한 RNA 전사체는 RNA 시퀀싱 데이터에서 3일째부터 발현되었다. FHF 마커는 3일과 11일 동안 높게 발현되었으며, SF 마커는 13일 이후 더 높게 표현되었다. 면역형광 얼룩은 인간의 심장을 구성하는 다양한 인간 심장 세포 형 혈통의 존재를 밝혔다.심근 및 상복부 조직, 내막 세포, 내피 세포 및 심장 섬유아세포와 같은. 상기 세포 계보를 발현하는 마커는 RNA SAC 유전자 발현 프로파일에서도 관찰되었다. 전체 오르가노이드에서 개별 세포의 살아있는 칼슘 화상 진찰은 오르가노이드의 전기 생리학적 기능을 측정하는 데 사용되었다.플루오-4 형광 강도는 정기적인 작용 잠재력을 드러내는 세포에서 칼슘 입구 출구로 인해 시간이 지남에 따라 다양합니다. 오르가노이드의 높은 배율 영역에 걸쳐 칼슘 강도를 보여주는 열지도, 칼슘 과도 및 개별 세포로 인한 증가 강도를 보여줍니다. 이 프로토콜을 시도할 때, EB와 후속 오르가노이드가 플레이트 의 바닥에 부착되지 않으며 세심한 미디어 변경이 필요한 미디어 외에도 제거와 함께 움직일 것입니다.오르가노이드는 성숙 기술에 도입된 장기간 배양또는 기계적 또는 전기 컨디셔닝과 같은 외부 자극, 독소와 같은 스트레스 요인에 노출될 수 있습니다. 이 기술은 연구에서 달리 접근 할 수없는 인간의 태아 심장 발달 단계에 대한 액세스를 허용, 심장 발달과 질병 병인학에 대한 새로운 통찰력의 길을 포장.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

연구

생화학

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

세포 외 포도당 고갈은 세포 및 조직 Ex vivo 에서 포도당 흡수의 간접적 인 척도로서

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

폐쇄형 반자동 워크플로우를 사용한 임상 적용을 위한 인간 중간엽 줄기 세포 처리

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...