Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under prisnumrene K01HL135464 og R01HL151505 og av American Heart Association under tildelingsnummer 19IPLOI34660342. Vi ønsker å takke MSU Advanced Microscopy Core og Dr. William Jackson ved MSU Department of Pharmacology and Toxicology for tilgang til konfikale mikroskoper, IQ Microscopy Core og MSU Genomics Core for sekvenseringstjenester. Vi ønsker også å takke alle medlemmer av Aguirre Lab for deres verdifulle kommentarer og råd.

1. hPSC kultur og vedlikehold
MERK: De menneskeskapte PSCene (hiPSCer) eller humane embryonale stamceller (hESCer) må dyrkes i minst 2 påfølgende passasjer etter opptining før de brukes til å generere EBs for differensiering eller ytterligere kryopreservering. hPSCer dyrkes i PSC-medium (se materialtabellen) på kjellermembran-ekstracellulær matrise (BM-ECM)-belagte 6-brønns kulturplater. Når du utfører middels endringer på hPSCer i 6-brønnsplater, legg mediet direkte...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

Nylige fremskritt i humane stamcelleavledede kardiomyocytter og andre celler med hjerteopprinnelse har blitt brukt til å modellere menneskelig hjerteutvikling22,24,25 og sykdom26,27,28 og som verktøy for å screene terapeutiske midler29,30 og giftige stoffer3...

Medfødte hjertefeil (CHD) er den vanligste typen medfødt defekt hos mennesker og påvirker ca. 1% av alle levendefødte1,2,3. Under de fleste omstendigheter forblir årsakene til CHDer ukjente. Evnen til å lage menneskelige hjertemodeller i laboratoriet som ligner på det utviklende menneskelige hjertet, utgjør et betydelig skritt fremover for å direkte studere de underliggende årsakene til CHD hos mennesker i stedet for i surrogatdyrmodeller.
Symbolet på laboratoriedyrkede vevsmodeller er organoider, 3D-cellekonstruksjoner som ligner et organ av interesse for cellesammensetning og fysiologisk funksjon. Organoider er ofte avledet fra stamceller eller stamceller og har blitt brukt til å modellere mange organer som hjernen4,5, nyre6,7, tarm8,9, lung10,11, lever12,13 og bukspyttkjertel14,15 , bare for å nevne noen. Nyere studier har dukket opp som viser muligheten for å skape selvmontering av hjerteorganoider for å studere hjerteutvikling in vitro. Disse modellene inkluderer bruk av mus embryonale stamceller (mESCs) for å modellere tidlig hjerteutvikling16,17 opp til atrioventricular spesifikasjon18 og menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) for å generere multi-bakterie lag hjerte-endoderm organoider19 og kamret kardioider20 med svært kompleks cellulær sammensetning.
Dette dokumentet presenterer en ny 3-trinns WNT-modulasjonsprotokoll for å generere svært komplekse hHOer på en effektiv og kostnadseffektiv måte. Organoider genereres i 96-brønnsplater, noe som resulterer i et skalerbart, høygjennomstrømningssystem som enkelt kan automatiseres. Denne metoden er avhengig av å skape hPSC aggregater og utløse utviklingstrinn av kardiogenese, inkludert mesoderm og hjertemesoderm dannelse, første og andre hjertefelt spesifikasjon, proepicardial organ dannelse, og atrioventricular spesifikasjon. Etter 15 dager med differensiering inneholder hHOer alle store celleavledninger som finnes i hjertet, veldefinerte indre kamre, atrie- og ventrikulære kamre og et vaskulært nettverk i hele organoiden. Dette svært sofistikerte og reproduserbare hjerteorganoidsystemet er egnet til å undersøke strukturelle, funksjonelle, molekylære og transkripsjonsmessige analyser i studiet av hjerteutvikling og sykdommer og farmakologisk screening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

Evnen til å studere menneskelig hjerteutvikling i helse og sykdom er svært begrenset av evnen til å modellere kompleksiteten til den menneskelige hjerteintroen. Å utvikle mer effektive organlignende plattformer som kan modellere komplekse in vivo-fenotyper , som organoider og organer-på-en-chip, vil forbedre evnen til å studere menneskelig hjerteutvikling og sykdom. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å generere svært komplekse humane hjerteorganoider (hHOer) ved hjelp av menneskelige pluripotente stamceller og trinnvis utviklingsveiaktivering ved hjelp av små molekylhemmere. Embryoide legemer (EBs) genereres i en 96-brønns plate med rundbunns, ultra-lave festebrønner, noe som letter suspensjonskulturen til individualiserte konstruksjoner.
EB-ene gjennomgår differensiering i hHOer ved en tre-trinns Wnt-signalmoduleringsstrategi, som innebærer en innledende Wnt-baneaktivering for å indusere hjertemesoderm skjebne, et andre trinn i Wnt-hemming for å skape definitive hjerteavstamninger, og et tredje Wnt-aktiveringstrinn for å indusere proepikardiale organvev. Disse trinnene, utført i et 96-brønns format, er svært effektive, reproduserbare og produserer store mengder organoider per løp. Analyse ved immunfluorescensavbildning fra dag 3 til dag 11 av differensiering avslører første og andre hjertefeltspesifikasjoner og svært komplekse vev inne i hHOer på dag 15, inkludert myokardvev med regioner av atrie- og ventrikulære kardiomyocytter, samt indre kamre foret med endokardvev. Organoidene har også et intrikat vaskulært nettverk gjennom hele strukturen og en ekstern foring av epikardialt vev. Fra et funksjonelt synspunkt slår hHOer robust og presenterer normal kalsiumaktivitet som bestemt av Fluo-4 levende bildebehandling. Samlet sett utgjør denne protokollen en solid plattform for in vitro-studier i humant organlignende hjertevev.

For å oppnå selvorganiserende hHO-in vitro modifiserte og kombinerte vi differensieringsprotokoller som tidligere er beskrevet for 2D-monolagsdifferensiering av kardiomyocytter21 og epikardiardialceller22 ved hjelp av Wnt-banemodulatorer og for 3D-prekariacorganoider16 ved hjelp av vekstfaktorene BMP4 og Activin A. Ved hjelp av 96-brønnsplaten EB og hHO differensieringsprotokollen beskrevet her og vist i figur 1</s...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Her beskriver vi en protokoll for å skape utviklingsrelevante humane hjerteorganoider (hHOer) effektivt ved hjelp av menneskelige pluripotente stamceller av selvorganisering. Protokollen er avhengig av sekvensiell aktivering av utviklingssignaler og produserer svært komplekse, funksjonelt relevante menneskelige hjertevev.

Generere selvmontering av humane hjerteorganoider avledet fra pluripotente stamceller

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Denne protokollen lar oss lage en kompleks 3D-struktur som ligner det utviklende menneskelige hjertet på en enkel kostnadseffektiv måte, som kan reproduseres på tvers av cellelinjer. Den består av en enkelt protokoll med tre trinn differensiering, noe som gir opphav til alle celletyper av hjertet, inkludert kamre og et vaskulært nettverk. Denne teknikken lar oss modellere et bredt spekter av menneskelige kardiovaskulære sykdommer og å screene effektive farmakologiske behandlinger.Takket være den høye gjennomstrømningen av designen. Denne metoden er nyttig for å undersøke det utviklende menneskelige hjertet så vel som sykdommer som vanligvis forbindes med det. En av dem er medfødte hjertefeil.Denne protokollen krever grunnleggende cellekulturferdigheter. Vi anbefaler oppmerksom og delikat pipettering samt skånsom håndtering av organoidene. Begynn med å lage embryoide kropper eller EBs to dager før differensiering.Vask undersamlende HPSCer med DBPS i minst 10 sekunder. Deretter aspirerer du DPBS. Tilsett en milliliter romtemperatur ACUTA og trykk forsiktig på platen omtrent fem ganger i minuttet i tre til fem minutter for å fremkalle løsrivelse, mens du sjekker under mikroskopet.Tilsett deretter en milliliter PSC-medium og Thias Avin eller Thias for å stoppe reaksjonen. Pipette media opp og ned i brønnen, to til tre ganger for å generere en enkelt celle suspensjon og samle cellene. Overfør deretter enkeltcellefjæringen til et sentrifugerør og spinn i fem minutter ved 300 ganger G.Aspirate supernatanten og gjenbruk cellene i en milliliter PSC-medium og Thias.Fortynn cellene i DPBS. Tell cellene ved hjelp av en celleteller eller hemo cystometer og fortynn cellene i PSC-medium med Thias til en konsentrasjon på 100 000 celler per milliliter. Tilsett 100 mikroliter fortynnede celler suspensjon til hver brønn av en rund bunn ultra lav vedlegg 96 brønnplate.Sentrifuger platen ved 100 ganger G i tre minutter og inkuber i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter 24 timer fjern forsiktig 50 mikroliter medium fra hver brønn og tilsett 200 kjerneavfall av fersk PSC-medium, varm til 37 grader Celsius for et volum på 250 mikroliter per brønn. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Fjern 166 mikroliter eller to tredjedeler av mediet fra den ene siden av hver brønn, og tilsett 166 mikroliter RPMI 1640 som inneholder insulinfritt B27-tilskudd, seks mikromolar jubel 990211, 0,875 nanogram per milliliter benmorfogenetisk protein fire og 1,5 nanogram per milliliter Activin A.Incubate i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter 24 timer fjern 166 mikroliter medium fra den ene siden av hver brønn og tilsett 166 mikroliter fersk RPMI 1640 med insulinfri B27 supplement. Inkuber i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.For å indusere hjertemesoderm spesifikasjon på dag to, fjern 166 mikroliter medium fra hver brønn og tilsett 166 mikroliter RPMI 1640, som inneholder insulinfri B27 supplement og tre mikromolar Wnt-C59 og fortsett inkubasjon i 48 timer. På dag fire fjerner du 166 mikroliter medium fra hver brønn og tilsetter 166 mikroliter fersk RPMI 1640 med insulinfritt B27-tilskudd, og inkuber deretter ytterligere 48 timer. På dag seks fjerner du 166 mikroliter medium fra hver brønn og tilsetter 166 mikroliter RPMI 1640 med B27 supplement.For dette og alle påfølgende medieendringer, bruk B27 supplement med insulin, inkubere i ytterligere 24 timer. På dag syv er cellekulturen klar for pro-epikardial differensiering. Fjern 166 mikroliter medium fra hver brønn og tilsett 166 mikroliter ferske RPMI 1640 som inneholder B27 supplement og tre mikromolar jubel 99021.Deretter i inkuber i en time, etter en time fjern platen fra inkubatoren, fjern 166 mikroliter medium fra den ene siden av hver brønn og tilsett 166 mikroliter fersk RPMI 1640 som inneholder B27 supplement fortsette inkubasjon i ytterligere 48 timer. Gjenta denne prosessen hver 48. Organoider er klare for analyser og eksperimentering på dag 15 For å overføre hele organoidene, kutt spissen av en P200 pipette, fem til 10 millimeter fra åpningen med en diameter på omtrent to til tre millimeter.Trykk pipettestempelets stempel og sett spissen vertikalt inn i den runde bunnen godt med organoiden. Ta opp omtrent 100 til 200 mikroliter medium nok til å samle organoidene og overføre dem til måldestinasjonen. Før differensiering EBS vises som svarte sfæriske masser, starter differensieringsprosessen på dag null med en Wnt-baneaktivering og vekstfaktortillegg i nøyaktig 24 timer.Videre redigering av Wnt C59 på dag to resulterer i utvidelse av organoid fra ca 200 mikrometer til maksimalt en millimeter. De menneskelige hjerteorganoidene begynte å slå så tidlig som dag seks og 100% av organoidene viste synlig juling ved dag 10. Høye forstørrelsesbilder av dag syv organoid avslørte at de fleste hånd en uttrykkende celler var kardiomyocytt i opprinnelse og hånd to var ikke myosittceller fra andre Heartfield, forfedre celler.RNA-transkripsjoner for både hånd en og hånd to ble uttrykt fra dag tre og utover i RNA-sekvenseringsdata. FHF-markørene ble sterkt uttrykt i løpet av dag tre og 11, mens SF-markøren ble mer høyt uttrykt etter dag 13. Immunfluorescence flekk avslørte tilstedeværelsen av ulike menneskelige hjertecelle type avstamninger som utgjør menneskehjertet.Som myokard- og epikardiale vev, endokardiale celler, endotelceller og hjertefibroblast. Markørene som uttrykker de ovennevnte cellelinjeformene ble også observert i RNA SAC-genuttrykksprofilene. Levende kalsiumavbildning av individuelle celler i hele organoider ble brukt til å måle organoidenes elektrofysiologiske funksjon.Fluo-4 fluorescensintensitet varierte over tid på grunn av kalsiuminngangsutgang fra cellen som avslører vanlige virkningspotensialer. Varmekart som viser kalsiumintensiteter over en høy forstørrelsesregion av organoiden, viser økt intensitet på grunn av kalsiumtransienter og individuelle celler. Når du prøver denne protokollen, må du huske på at EB-ene og påfølgende organoider ikke er festet til bunnen av platen, og vi vil bevege oss rundt med fjerning i tillegg til medier som krever oppmerksomme medieendringer.Organoider kan være kultur i lengre perioder introdusert for modningsteknikker, eller til og med utsatt for ytre stimuli, for eksempel mekanisk eller elektrisk kondisjonering, og til og med stressorer som giftstoffer. Denne teknikken tillater tilgang til stadier av menneskelig foster hjerteutvikling som ellers er utilgjengelig i forskning, og baner vei for ny innsikt i hjerteutvikling og sykdomsetiologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anriking av vaskemiddel-uløselig Protein aggregater fra Postmortem hjernen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En vestlig Blotting protokollen for lite antall blodkreft stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus testikkel

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Rask isolering av Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk Proteomic og miRNA analyse av Polysomes fra isolert musen hjertet etter Langendorff perfusjon

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Styrking av engraftment av humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet Cardiomyocytes via en forbigående hemming av Rho kinase aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseuttømming som et indirekte mål på glukoseopptak i celler og vev ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Human mesenkymal stamcellebehandling for kliniske applikasjoner ved bruk av en lukket, halvautomatisk arbeidsflyt

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...