Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação K01HL135464 e R01HL15151505 e pela American Heart Association sob o prêmio número 19IPLOI34660342. Agradecemos ao Núcleo avançado de Microscopia da MSU e ao Dr. William Jackson do Departamento de Farmacologia e Toxicologia da MSU pelo acesso aos microscópios confocal, ao Núcleo de Microscopia de QI e ao Núcleo de Genômica da MSU para serviços de sequenciamento. Também queremos agradecer a todos os membros do Laboratório Aguirre por seus valiosos comentários e conselhos.

1. cultura e manutenção hPSC
NOTA: Os PSCs induzidos por humanos (hiPSCs) ou células-tronco embrionárias humanas (hESCs) precisam ser cultivados por pelo menos 2 passagens consecutivas após o descongelamento antes de serem usados para gerar EBs para diferenciação ou criopreservação. hPSCs são cultivados em meio PSC (ver a Tabela de Materiais) em placas de cultura de 6 poços revestidos de membrana de porão (BM-ECM) revestidos de 6 poços. Ao realizar alterações méd...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

Avanços recentes em cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas e outras células de origem cardíaca têm sido usados para modelar o desenvolvimento do coração humano22,24,25 e doenças26,27,28 e como ferramentas para triagem de terapêutica29,30 e agentes <sup cla...

Os defeitos cardíacos congênitos (CHDs) são o tipo mais comum de defeito congênito em humanos e afetam aproximadamente 1% de todos os nascidos vivos1,2,3. Na maioria das circunstâncias, as razões para os CHDs permanecem desconhecidas. A capacidade de criar modelos de coração humano no laboratório que se assemelham muito ao coração humano em desenvolvimento constitui um passo significativo para estudar diretamente as causas subjacentes dos CHDs em humanos e não em modelos animais substitutos.
O epítome de modelos de tecido cultivados em laboratório são organoides, construções de células 3D que se assemelham a um órgão de interesse na composição celular e função fisiológica. Organoides são frequentemente derivados de células-tronco ou células progenitoras e têm sido usados com sucesso para modelar muitos órgãos como o cérebro4,5, rim6,7, intestino8,9, pulmão10,11, fígado12,13 e pâncreas14,15 , só para citar alguns. Estudos recentes surgiram demonstrando a viabilidade de criar organoides cardíacos auto-montados para estudar o desenvolvimento cardíaco in vitro. Esses modelos incluem o uso de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) para modelar o desenvolvimento cardíaco precoce16,17 até especificações atrioventriculares18 e células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para gerar organoides de endoderme de camada plamífica de camada plamícidos 19 e cardiodos de câmara20 com composição celular altamente complexa.
Este artigo apresenta um novo protocolo de modulação WNT de 3 passos para gerar hHOs altamente complexos de forma eficiente e econômica. Organoides são gerados em placas de 96 poços, resultando em um sistema escalável e de alta produtividade que pode ser facilmente automatizado. Este método se baseia na criação de agregados de hPSC e no desencadeamento de etapas de desenvolvimento da cardiogênese, incluindo mesodermia e formação de mesoderm cardíaco, especificação de primeiro e segundo campo cardíaco, formação de órgãos proepicardial e especificação atrioventricular. Após 15 dias de diferenciação, os HHOs contêm todas as principais linhagens celulares encontradas no coração, câmaras internas bem definidas, câmaras atrial e ventricular, e uma rede vascular em todo o organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado e reprodutível é favorável à investigação de análises estruturais, funcionais, moleculares e transcriômicas no estudo do desenvolvimento cardíaco e doenças e rastreamento farmacológico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

A capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano em saúde e doença é altamente limitada pela capacidade de modelar a complexidade do coração humano in vitro. O desenvolvimento de plataformas mais eficientes semelhantes a órgãos que podem modelar fenótipos complexos in vivo , como organoides e órgãos em um chip, aumentará a capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano e doenças. Este artigo descreve um protocolo para gerar organoides cardíacos humanos altamente complexos (hHOs) por auto-organização usando células-tronco pluripotentes humanas e ativação de caminhos de desenvolvimento stepwise usando inibidores de pequenas moléculas. Os corpos embrionários (EBs) são gerados em uma placa de 96 poços com fundo redondo, poços de fixação ultra-baixo, facilitando a cultura de suspensão de construções individualizadas.
Os EBs sofrem diferenciação em hHOs por uma estratégia de modulação de sinalização WNT de três etapas, que envolve uma ativação inicial da via WNT para induzir o destino do mesoderm cardíaco, um segundo passo da inibição de Wnt para criar linhagens cardíacas definitivas, e um terceiro passo de ativação wnt para induzir tecidos proepicardiais de órgãos. Essas etapas, realizadas em formato de 96 poços, são altamente eficientes, reprodutíveis e produzem grandes quantidades de organoides por execução. A análise por imagens de imunofluorescência do dia 3 ao dia 11 de diferenciação revela especificações de campo cardíaco de primeiro e segundo e tecidos de alta complexidade dentro dos HHOs no dia 15, incluindo tecido miocárdio com regiões de cardiomiócitos atrial e ventricular, bem como câmaras internas forradas com tecido endocardial. Os organoides também exibem uma intrincada rede vascular em toda a estrutura e um revestimento externo de tecido epicártico. Do ponto de vista funcional, os HHOs batem robustamente e apresentam atividade normal de cálcio, conforme determinado pela imagem ao vivo fluo-4. No geral, este protocolo constitui uma plataforma sólida para estudos in vitro em tecidos cardíacos semelhantes a órgãos humanos.

Para alcançar a auto-organização hHO in vitro, modificamos e combinamos protocolos de diferenciação previamente descritos para diferenciação de monocamadas 2D de células cardiomiocós-ástica21 e epicárida22 usando moduladores de via Wnt e para organoides pré-cardiaco 3D16 usando os fatores de crescimento BMP4 e Activin A. Utilizando a placa de 96 poços EB e protocolo de diferenciação hHO descritos aqui e mostrados na <strong cl...

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Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Aqui, descrevemos um protocolo para criar organoides cardíacos humanos relevantes de desenvolvimento (hHOs) usando eficientemente células-tronco pluripotentes humanas por auto-organização. O protocolo conta com a ativação sequencial de pistas de desenvolvimento e produz tecidos cardíacos humanos altamente complexos e funcionalmente relevantes.

Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Este protocolo nos permite criar uma complexa estrutura 3D que se assemelha muito ao coração humano em desenvolvimento de uma forma simples e econômica, que é reprodutível através das linhas celulares. Consiste em um único protocolo com três passos de diferenciação, o que dá origem a todos os tipos celulares do coração, incluindo câmaras e uma rede vascular. Essa técnica nos permite modelar uma ampla gama de doenças cardiovasculares humanas e testar tratamentos farmacológicos eficazes.Graças à natureza de alto rendimento de seu design. Este método é útil para investigar o coração humano em desenvolvimento, bem como doenças comumente associadas a ele. Um deles é defeito cardíaco congênito.Este protocolo requer habilidades básicas de cultura celular. Recomendamos tubos atentos e delicados, bem como manuseio suave dos organoides. Comece criando corpos embrionários ou EBs dois dias antes da diferenciação.Lave HPSCs subconfluentes com DBPS por pelo menos 10 segundos. Em seguida, aspire o DPBS. Adicione um mililitro de ACUTA de temperatura ambiente e bata suavemente na placa aproximadamente cinco vezes por minuto durante três a cinco minutos para induzir o desprendimento, enquanto estiver verificando sob o microscópio.Em seguida, adicione um mililitro de meio PSC e Thias Avin ou Thias para parar a reação. Pipeta a mídia para cima e para baixo no poço, duas a três vezes para gerar uma única suspensão celular e coletar as células. Em seguida, transfira a suspensão celular única para um tubo de centrífuga e gire por cinco minutos a 300 vezes G.Aspire o supernasce e repasse as células em um mililitro de meio PSC e Thias.Diluir as células em DPBS. Conte as células usando um contador celular ou cistometro hemo e dilua as células em meio PSC com Thias a uma concentração de 100.000 células por mililitro. Adicione 100 microliters de suspensão de células diluídas a cada poço de uma placa de fundo ultra baixa 96.Centrifugar a placa a 100 vezes G por três minutos e incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas remova cuidadosamente 50 microliters de médio de cada poço e adicione 200 ninhadas de tamanho baixo de PSC médio fresco, quente a 37 graus Celsius para um volume de 250 microliters por poço. Incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Remova 166 microliters ou dois terços do meio de um lado de cada poço, e adicionar 166 microliters de RPMI 1640 contendo suplemento B27 livre de insulina, seis 990211 de animação micromolar, 0,875 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea quatro e 1,5 nanogramas por mililitro de Activin A.Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5%dióxido de carbono. Após 24 horas remova 166 microliters de meio de um lado de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 com suplemento B27 livre de insulina. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para induzir a especificação do mesoderm cardíaco no segundo dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI 1640, contendo suplemento B27 livre de insulina e três micromolar Wnt-C59 e continue a incubação por 48 horas. No quarto dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 com suplemento B27 livre de insulina, depois incubar mais 48 horas. No sexto dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI 1640 com suplemento B27.Para isso e todas as alterações posteriores da mídia, use suplemento B27 com insulina, incubar por mais 24 horas. No sétimo dia, a cultura celular está pronta para diferenciação pro epicárardia. Remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B27 e três micromolar cheer 99021.Em seguida, incubar por uma hora, após uma hora remover a placa da incubadora, remover 166 microliters de meio de um lado de cada poço e adicionar 166 microliters de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B27 continuar incubação por mais 48 horas. Repita este processo a cada 48 horas até a coleta. Organoides estão prontos para análises e experimentações no dia 15 Para transferir todos os organoides, corte a ponta de uma pipeta P200, de cinco a 10 milímetros da abertura com um diâmetro de aproximadamente dois a três milímetros.Pressione o êmbolo da pipeta e insira a ponta verticalmente no fundo redondo bem com o organoide. Pegue aproximadamente 100 a 200 microliters de médio o suficiente para coletar os organoides e transferi-los para o destino alvo. Antes da diferenciação, o EBS aparece como massas esféricas dos negros, o processo de diferenciação começa no dia zero com uma ativação de via wnt e adição de fator de crescimento por exatamente 24 horas.Além disso, a edição do WNT C59 no segundo dia resulta em ampliação do organoide de aproximadamente 200 micrômetros para um máximo de um milímetro. Os organoides do coração humano começaram a bater logo no sexto dia e 100% dos organoides mostraram batidas visíveis no dia 10. Imagens de alta ampliação do dia sete organoide revelaram que a maioria das células expressas de mãos eram cardiomiócitos de origem e duas mãos eram células não mísitas do segundo Heartfield, células progenitoras.As transcrições de RNA para mão um e duas mãos foram expressas a partir do terceiro dia em dados de sequenciamento de RNA. Os marcadores FHF foram altamente expressos durante os dias três e 11, enquanto o marcador SF foi mais expresso após o dia 13. A mancha de imunofluorescência revelou a presença de várias linhagens do tipo células cardíacas humanas que compõem o coração humano.Como tecido miocárdio e epicardial, células do endocárdio, células endoteliais e fibroblasto cardíaco. Os marcadores que expressam as linhagens celulares acima também foram observados nos perfis de expressão genética RNA SAC. A imagem viva de cálcio de células individuais em organoides inteiros foi usada para medir a função eletrofisiológica dos organoides.A intensidade da fluorescência fluo-4 variou ao longo do tempo devido à saída de entrada de cálcio da célula revelando potenciais de ação regulares. Mapas de calor mostrando intensidades de cálcio sobre uma região de alta ampliação do organoide, mostram aumento da intensidade devido aos transitórios de cálcio e células individuais. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que os EBs e organoides subsequentes não estão ligados à parte inferior da placa, e vamos nos mover com a remoção, além de mídia que exige mudanças atentas na mídia.Organoides podem ser cultura por períodos mais longos de tempo introduzidos em técnicas de maturação, ou mesmo expostos a estímulos externos, como condicionamento mecânico ou elétrico, e até estressores como toxinas. Essa técnica permite, como acesso a estágios do desenvolvimento do coração fetal humano, que de outra forma são inacessíveis na pesquisa, abrindo caminho para novas percepções sobre o desenvolvimento cardíaco e etiologia de doenças.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Bioquímica

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Isolamento rápido do Mitoribosome de células HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Esgotamento da glicose extracelular como medida indireta de captação de glicose em células e tecidos Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Processamento de células-tronco mesenquimais humanas para aplicações clínicas usando um fluxo de trabalho semi-automatizado fechado

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...