Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio K01HL135464 y R01HL151505 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342. Deseamos agradecer al Núcleo de Microscopía Avanzada de MSU y al Dr. William Jackson en el Departamento de Farmacología y Toxicología de MSU por el acceso a microscopios confocales, el Núcleo de Microscopía IQ y el Núcleo de Genómica MSU por los servicios de secuenciación. También queremos agradecer a todos los miembros del Laboratorio Aguirre por sus valiosos comentarios y consejos.

1. Cultura y mantenimiento de hPSC
NOTA: Las PSC inducidas por humanos (hiPSC) o las células madre embrionarias humanas (hESC) deben cultivarse durante al menos 2 pasajes consecutivos después de la descongelación antes de ser utilizadas para generar EB para la diferenciación o la criopreservación adicional. Las hPSC se cultivan en medio PSC (consulte la Tabla de materiales) en placas de cultivo de 6 pocillos recubiertas de matriz extracelular de membrana basal (BM-ECM). Al ...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. 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Los recientes avances en cardiomiocitos derivados de células madre humanas y otras células de origen cardíaco se han utilizado para modelar el desarrollo del corazón humano22,24,25 y la enfermedad26,27,28 y como herramientas para detectar terapias29,30 y agentes <sup class="...

Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos y afectan aproximadamente al 1% de todos los nacidos vivos1,2,3. En la mayoría de las circunstancias, las razones de los CHD siguen siendo desconocidas. La capacidad de crear modelos de corazón humano en el laboratorio que se asemejan mucho al corazón humano en desarrollo constituye un importante paso adelante para estudiar directamente las causas subyacentes de las enfermedades coronarias en humanos en lugar de en modelos animales sustitutos.
El epítome de los modelos de tejido cultivados en laboratorio son organoides, construcciones de células 3D que se asemejan a un órgano de interés en la composición celular y la función fisiológica. Los organoides a menudo se derivan de células madre o células progenitoras y se han utilizado con éxito para modelar muchos órganos como el cerebro4,5, el riñón6,7, el intestino8,9, el pulmón10,11, el hígado12,13 y el páncreas14,15 , solo por nombrar algunos. Han surgido estudios recientes que demuestran la viabilidad de crear organoides cardíacos autoensamblables para estudiar el desarrollo del corazón in vitro. Estos modelos incluyen el uso de células madre embrionarias de ratón (mESCs) para modelar el desarrollo cardíaco temprano16,17 hasta la especificación auriculoventricular18 y células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para generar organoides cardíaco-endodermo de capa multigermes19 y cardioides con cámara20 con composición celular altamente compleja.
Este artículo presenta un novedoso protocolo de modulación WNT de 3 pasos para generar hHO altamente complejos de una manera eficiente y rentable. Los organoides se generan en placas de 96 pocillos, lo que resulta en un sistema escalable y de alto rendimiento que se puede automatizar fácilmente. Este método se basa en la creación de agregados de hPSC y desencadena los pasos de desarrollo de la cardiogénesis, incluida la formación de mesodermo y mesodermo cardíaco, la especificación del primer y segundo campo cardíaco, la formación de órganos proepicárdicos y la especificación auriculoventricular. Después de 15 días de diferenciación, los hHO contienen todos los linajes celulares principales que se encuentran en el corazón, cámaras internas bien definidas, cámaras auriculares y ventriculares, y una red vascular en todo el organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado y reproducible es susceptible de investigar análisis estructurales, funcionales, moleculares y transcriptómicos en el estudio del desarrollo cardíaco y las enfermedades, y la detección farmacológica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

La capacidad de estudiar el desarrollo cardíaco humano en la salud y la enfermedad está muy limitada por la capacidad de modelar la complejidad del corazón humano in vitro. El desarrollo de plataformas similares a órganos más eficientes que puedan modelar fenotipos complejos in vivo , como organoides y órganos en un chip, mejorará la capacidad de estudiar el desarrollo y la enfermedad del corazón humano. Este artículo describe un protocolo para generar organoides cardíacos humanos (hHO) altamente complejos mediante la autoorganización utilizando células madre pluripotentes humanas y la activación gradual de la vía de desarrollo utilizando inhibidores de moléculas pequeñas. Los cuerpos embrionarios (EB) se generan en una placa de 96 pocillos con pocillos de fijación ultra bajos de fondo redondo, lo que facilita el cultivo en suspensión de construcciones individualizadas.
Los EB se diferencian en hHO mediante una estrategia de modulación de señalización Wnt de tres pasos, que implica una activación inicial de la vía Wnt para inducir el destino del mesodermo cardíaco, un segundo paso de inhibición Wnt para crear linajes cardíacos definitivos y un tercer paso de activación Wnt para inducir tejidos de órganos proepicárdicos. Estos pasos, llevados a cabo en un formato de 96 pocillos, son altamente eficientes, reproducibles y producen grandes cantidades de organoides por tirada. El análisis por imágenes de inmunofluorescencia del día 3 al día 11 de la diferenciación revela especificaciones del primer y segundo campo cardíaco y tejidos altamente complejos dentro de hHOs en el día 15, incluido el tejido miocárdico con regiones de cardiomiocitos auriculares y ventriculares, así como cámaras internas revestidas con tejido endocárdico. Los organoides también exhiben una intrincada red vascular en toda la estructura y un revestimiento externo de tejido epicárdico. Desde un punto de vista funcional, los hHO superan con fuerza y presentan una actividad normal del calcio según lo determinado por las imágenes en vivo de Fluo-4. En general, este protocolo constituye una plataforma sólida para estudios in vitro en tejidos cardíacos similares a órganos humanos.

Para lograr la hHO autoorganizada in vitro, modificamos y combinamos los protocolos de diferenciación previamente descritos para la diferenciación monocapa 2D de cardiomiocitos21 y células epicárdicas22 utilizando moduladores de la vía Wnt y para organoides precardíacos 3D16 utilizando los factores de crecimiento BMP4 y Activina A. Utilizando el protocolo de diferenciación EB y hHO de placa de 96 pocillos descrito aquí y mostrado en ...

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Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Aquí, describimos un protocolo para crear organoides cardíacos humanos (hHO) relevantes para el desarrollo de manera eficiente utilizando células madre pluripotentes humanas por autoorganización. El protocolo se basa en la activación secuencial de señales de desarrollo y produce tejidos cardíacos humanos altamente complejos y funcionalmente relevantes.

Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Este protocolo nos permite crear una estructura 3D compleja que se asemeja mucho al corazón humano en desarrollo de una manera simple y rentable, que es reproducible a través de líneas celulares. Consiste en un único protocolo con tres pasos de diferenciación, que da lugar a todos los tipos celulares del corazón, incluyendo cámaras y una red vascular. Esta técnica nos permite modelar una amplia gama de enfermedades cardiovasculares humanas y detectar tratamientos farmacológicos efectivos.Gracias a la naturaleza de alto rendimiento de su diseño. Este método es útil para investigar el corazón humano en desarrollo, así como las enfermedades comúnmente asociadas con él. Uno de ellos son los defectos cardíacos congénitos.Este protocolo requiere habilidades básicas de cultivo celular. Recomendamos pipeteos atentos y delicados, así como un manejo suave de los organoides. Comience creando cuerpos embrioides o EB dos días antes de la diferenciación.Lave los HPSC subconfluentes con DBPS durante al menos 10 segundos. A continuación, aspire el DPBS. Agregue un mililitro de ACUTA a temperatura ambiente y golpee suavemente la placa aproximadamente cinco veces cada minuto durante tres a cinco minutos para inducir el desprendimiento, mientras se verifica bajo el microscopio.Luego agregue un mililitro de medio PSC y Thias Avin o Thias para detener la reacción. Pipetear los medios hacia arriba y hacia abajo en el pozo, dos o tres veces para generar una suspensión de una sola célula y recolectar las células. Luego transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo de centrífuga y gire durante cinco minutos a 300 veces G.Aspire el sobrenadante y vuelva a gastar las células en un mililitro de medio PSC y Thias.Diluir las células en DPBS. Cuente las células usando un contador celular o un hemocisómetro y diluya las células en medio PSC con Thias a una concentración de 100, 000 células por mililitro. Agregue 100 microlitros de suspensión de células diluidas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja de fondo redondo.Centrifugar la placa a 100 veces G durante tres minutos e incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, retire cuidadosamente 50 microlitros de medio de cada pozo y agregue 200 camadas de núcleo de medio PSC fresco, caliente a 37 grados Celsius para un volumen de 250 microlitros por pozo. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Retire 166 microlitros o dos tercios de medio de un lado de cada pozo, y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 que contengan suplemento de B27 sin insulina, seis 990211 de alegría micromolar, 0.875 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea cuatro y 1.5 nanogramos por mililitro de Activina A.Incube durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas retire 166 microlitros de medio de un lado de cada pocillo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco con suplemento de B27 sin insulina. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Para inducir la especificación del mesodermo cardíaco en el segundo día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640, que contengan suplemento de B27 sin insulina y tres micromolares Wnt-C59 y continúe la incubación durante 48 horas. En el cuarto día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco con suplemento de B27 sin insulina, luego incube otras 48 horas. En el sexto día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 con suplemento de B27.Para este y todos los cambios de medios posteriores, use suplemento de B27 con insulina, incube durante otras 24 horas. En el séptimo día, el cultivo celular está listo para la diferenciación pro epicárdica. Retire 166 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B27 y tres micromolares cheer 99021.Luego, en incubar durante una hora, después de una hora retire la placa de la incubadora, retire 166 microlitros de medio de un lado de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B27 continúe la incubación durante otras 48 horas. Repite este proceso cada 48 horas hasta la recogida. Los organoides están listos para análisis y experimentación el día 15 Para transferir los organoides completos, corte la punta de una pipeta P200, de cinco a 10 milímetros de la abertura con un diámetro de aproximadamente dos a tres milímetros.Presione el émbolo de pipeta e inserte la punta verticalmente en el pozo inferior redondo con el organoide. Tome aproximadamente de 100 a 200 microlitros de medio suficiente para recolectar los organoides y transferirlos al destino objetivo. Antes de que la EBS de diferenciación aparezca como masas esféricas negras, el proceso de diferenciación comienza en el día cero con una activación de la vía Wnt y la adición del factor de crecimiento durante exactamente 24 horas.Además, la edición de Wnt C59 en el segundo día da como resultado un agrandamiento del organoide de aproximadamente 200 micrómetros a un máximo de un milímetro. Los organoides del corazón humano comenzaron a latir tan pronto como el día seis y el 100% de los organoides mostraron latidos visibles en el día 10. Las imágenes de alto aumento del organoide del día siete revelaron que la mayoría de las células que expresaban la mano uno eran de origen cardiomiótico y la mano dos eran células no miositas de segunda células progenitoras del campo cardíaco.Las transcripciones de ARN tanto para la mano uno como para la mano dos se expresaron a partir del tercer día en los datos de secuenciación de ARN. Los marcadores FHF se expresaron altamente durante los días tres y 11, mientras que el marcador SF se expresó más altamente después del día 13. La tinción de inmunofluorescencia reveló la presencia de varios linajes de tipo de células cardíacas humanas que componen el corazón humano.Como el tejido miocárdico y epicárdico, las células endocárdicas, las células endoteliales y los fibroblastos cardíacos. Los marcadores que expresan los linajes celulares anteriores también se observaron en los perfiles de expresión del gen RNA SAC. Se utilizaron imágenes de calcio vivo de células individuales en organoides enteros para medir la función electrofisiológica de los organoides.La intensidad de la fluorescencia fluo-4 varió con el tiempo debido a la salida de entrada de calcio de la célula que revela potenciales de acción regulares. Los mapas de calor que muestran las intensidades de calcio sobre una región de alto aumento del organoide, muestran una mayor intensidad debido a los transitorios de calcio y las células individuales. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que los EB y los organoides posteriores no están unidos a la parte inferior de la placa, y nos moveremos con la eliminación además de los medios que requieren cambios de medios atentos.Los organoides pueden ser cultivados durante períodos de tiempo más largos introducidos en las técnicas de maduración, o incluso expuestos a estímulos externos, como el acondicionamiento mecánico o eléctrico, e incluso a factores estresantes como las toxinas. Esta técnica permite el acceso a etapas del desarrollo del corazón fetal humano que de otro modo serían inaccesibles en la investigación, allanando el camino para nuevos conocimientos sobre el desarrollo del corazón y la etiología de la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Investigación

Bioquímica

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

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Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

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El agotamiento extracelular de glucosa como medida indirecta de la absorción de glucosa en células y tejidos ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Procesamiento de células madre mesenquimales humanas para aplicaciones clínicas utilizando un flujo de trabajo semiautomatizado cerrado

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...