Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer K01HL135464 och R01HL151505 och av American Heart Association under tilldelningsnummer 19IPLOI34660342. Vi vill tacka MSU Advanced Microscopy Core och Dr. William Jackson vid MSU Department of Pharmacology and Toxicology för tillgång till konfokala mikroskop, IQ Microscopy Core och MSU Genomics Core för sekvenseringstjänster. Vi vill också tacka alla medlemmar i Aguirre Lab för deras värdefulla kommentarer och råd.

1. hPSC-kultur och underhåll
OBS: De humana inducerade PSC (hiPSCs) eller mänskliga embryonala stamceller (hESCs) måste odlas i minst 2 på varandra följande passager efter upptining innan de används för att generera EBs för differentiering eller ytterligare kryopreservation. hPSCs odlas i PSC-medium (se materialtabellen) på källarmembran-extracellulär matris (BM-ECM)-belagda 6-brunnskulturplattor. När du utför medelstora förändringar på hPSCs i 6-brunnsplattor, t...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

De senaste framstegen inom humana stamcellsbaserade kardiomyocyter och andra celler av hjärtursprung har använts för att modellera mänsklig hjärtutveckling22,24,25 och sjukdom26,27,28 och som verktyg för att screena terapeutiska läkemedel29,30 och giftiga <sup class="xre...

Medfödda hjärtfel (CHD) är den vanligaste typen av medfödd defekt hos människor och påverkar cirka 1% av alla levande födda1,2,3. Under de flesta omständigheter är orsakerna till chd fortfarande okända. Förmågan att skapa mänskliga hjärtmodeller i labbet som liknar det utvecklande mänskliga hjärtat utgör ett viktigt steg framåt för att direkt studera de underliggande orsakerna till CHD hos människor snarare än i surrogatdjurmodeller.
Symbolen för laboratorieodlade vävnadsmodeller är organoider, 3D-cellkonstruktioner som liknar ett organ av intresse för cellsammansättning och fysiologisk funktion. Organoider härrör ofta från stamceller eller stamceller och har framgångsrikt använts för att modellera många organ som hjärnan4,5, njure6,7, tarm8,9, lung10,11, lever12,13 och bukspottkörtel14,15 , bara för att nämna några. Nyligen genomförda studier har dykt upp som visar möjligheten att skapa självmonterande hjärtorganoider för att studera hjärtutveckling in vitro. Dessa modeller inkluderar användning av mus embryonala stamceller (mESCs) för att modellera tidig hjärtutveckling16,17 upp till atrioventrikulär specifikation18 och mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) för att generera multi-bakterie lager hjärt-endoderm organoider19 och kammade kardioider20 med mycket komplex cellulär sammansättning.
Detta dokument presenterar ett nytt 3-stegs WNT modulering protokoll för att generera mycket komplexa hHOs på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt. Organoider genereras i 96-brunnsplattor, vilket resulterar i ett skalbart system med hög genomströmning som enkelt kan automatiseras. Denna metod bygger på att skapa hPSC aggregat och utlösa utvecklingsmässiga steg av cardiogenesis, inklusive mesoderm och hjärt mesoderm bildandet, första och andra hjärtat fält specifikation, proepicardial organ bildas och atrioventricular specifikation. Efter 15 dagar av differentiering innehåller hHOs alla större cell härstamningar som finns i hjärtat, väldefinierade inre kammare, förmakscelliga och ventrikulära kammare och ett vaskulär nätverk i hela organoiden. Detta mycket sofistikerade och reproducerbara hjärtorganoidsystem är mottagligt för att undersöka strukturella, funktionella, molekylära och transkriptomiska analyser i studien av hjärtutveckling och sjukdomar och farmakologisk screening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

Förmågan att studera mänsklig hjärtutveckling i hälsa och sjukdom är mycket begränsad av förmågan att modellera komplexiteten hos det mänskliga hjärtat in vitro. Att utveckla effektivare organliknande plattformar som kan modellera komplexa in vivo-fenotyper , såsom organoider och organ-på-ett-chip, kommer att förbättra förmågan att studera mänsklig hjärtutveckling och sjukdom. Detta dokument beskriver ett protokoll för att generera mycket komplexa mänskliga hjärtat organoider (hHOs) genom självorganisering med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller och stegvis utvecklingsmässiga utbildningsaktivering med hjälp av små molekylhämmare. Embryoidkroppar (EBs) genereras i en 96-brunnsplatta med rundbottnade, ultralåga fästbrunnar, vilket underlättar suspensionskulturen hos individualiserade konstruktioner.
EBs genomgår differentiering i hHOs genom en tre-steg Wnt signalering modulering strategi, som innebär en första Wnt utbildnings aktivering för att inducera hjärt mesoderm öde, ett andra steg av Wnt hämning för att skapa slutgiltiga hjärt härstamningar och en tredje Wnt aktivering steg för att inducera proepicardial organ vävnader. Dessa steg, utförda i ett 96-brunnsformat, är mycket effektiva, reproducerbara och producerar stora mängder organoider per körning. Analys av immunofluorescens imaging från dag 3 till dag 11 av differentiering avslöjar första och andra hjärtat fält specifikationer och mycket komplexa vävnader inuti hHOs dag 15, inklusive hjärtmuskel vävnad med regioner av förmakscancer och ventrikulärt kardiomyocyter, samt inre kammare fodrade med endokardial vävnad. Organoiderna uppvisar också ett invecklat vaskulär nätverk genom hela strukturen och ett yttre foder av epicardial vävnad. Ur funktionell synvinkel slår hHOs robust och presenterar normal kalciumaktivitet som bestäms av Fluo-4 live imaging. Sammantaget utgör detta protokoll en solid plattform för in vitro-studier i mänskliga organliknande hjärtvävnader.

För att uppnå självorganiserande hHO in vitro, ändrade vi och kombinerade differentieringsprotokoll som tidigare beskrivits för 2D monolayer differentiering av kardiomyocyter21 och epicardial celler22 med Wnt utbildningsmodulatorer och för 3D precardiac organoider16 med hjälp av tillväxtfaktorerna BMP4 och Activin A. Med hjälp av 96-brunnsplattan EB och hHO differentieringsprotokoll som beskrivs här och visas i figur 1<sup cl...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Här beskriver vi ett protokoll för att skapa utvecklingsrelevanta humana hjärtorganoider (hHOs) effektivt med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller genom självorganisering. Protokollet bygger på sekventiell aktivering av utvecklingssignaler och producerar mycket komplexa, funktionellt relevanta mänskliga hjärtvävnader.

Generera självmonterande mänskliga hjärtorganoider som härrör från pluripotenta stamceller

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Detta protokoll gör det möjligt för oss att skapa en komplex 3D-struktur som liknar det utvecklande mänskliga hjärtat på ett enkelt kostnadseffektivt sätt, som är reproducerbart över cellinjer. Det består av ett enda protokoll med tre steg av differentiering, vilket ger upphov till alla celltyper i hjärtat, inklusive kamrar och ett kärlnätverk. Denna teknik gör det möjligt för oss att modellera ett brett spektrum av mänskliga hjärt-kärlsjukdomar och att screena effektiva farmakologiska behandlingar.Tack vare den höga genomströmningskaraktären i sin design. Denna metod är användbar för att undersöka det utvecklande mänskliga hjärtat samt sjukdomar som vanligtvis förknippas med det. En av dem är medfödda hjärtfel.Detta protokoll kräver grundläggande cellkulturfärdigheter. Vi rekommenderar uppmärksam och delikat pipettering samt skonsam hantering av organoiderna. Börja med att skapa embryoida kroppar eller EBs två dagar före differentiering.Tvätta underkonfluent HPSCs med DBPS i minst 10 sekunder. Aspirera sedan DPBS. Tillsätt en milliliter ACUTA i rumstemperatur och knacka försiktigt på plattan ungefär fem gånger per minut i tre till fem minuter för att framkalla avskildhet, samtidigt som du kontrollerar under mikroskopet.Tillsätt sedan en milliliter PSC-medium och Thias Avin eller Thias för att stoppa reaktionen. Pipettera mediet upp och ner i brunnen, två till tre gånger för att generera en enda cellfjädring och samla cellerna. Överför sedan encellsfjädringen till ett centrifugrör och snurra i fem minuter vid 300 gånger G.Aspirate supernatanten och spendera cellerna i en milliliter PSC-medium och Thias.Späd ut cellerna i DPBS. Räkna cellerna med hjälp av en cellräknare eller hemocystometer och späd cellerna i PSC-medium med Thias till en koncentration av 100 000 celler per milliliter. Tillsätt 100 mikroliter utspädd cellsuspension till varje brunn i en rund botten ultralåg fastsättning 96 brunnsplatta.Centrifugera plattan vid 100 gånger G i tre minuter och inkubera i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter 24 timmar ta försiktigt bort 50 mikroliter medium från varje brunn och tillsätt 200 kärnskräp av färskt PSC-medium, varmt till 37 grader Celsius för en volym på 250 mikroliter per brunn. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Ta bort 166 mikroliter eller två tredjedelar medium från ena sidan av varje brunn och tillsätt 166 mikroliter RPMI 1640 innehållande insulinfritt B27-tillägg, sex mikromolar cheer 990211, 0,875 nanogram per milliliter benmorfogenetiskt protein fyra och 1,5 nanogram per milliliter Activin A.Incubate i 24 timmar vid 37 grader celsius. Efter 24 timmar ta bort 166 mikroliter medium från ena sidan av varje brunn och tillsätt 166 mikroliter av färsk RPMI 1640 med insulinfri B27 tillägg. Inkubera i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.För att inducera hjärt mesoderm specifikation på dag två, ta bort 166 mikroliter medium från varje brunn och tillsätt 166 mikroliter RPMI 1640, innehållande insulinfri B27 tillägg och tre mikromolar Wnt-C59 och fortsätt inkubation i 48 timmar. På dag fyra, ta bort 166 mikroliter medium från varje brunn och tillsätt 166 mikroliter av färsk RPMI 1640 med insulinfritt B27-tillägg och inkubera sedan ytterligare 48 timmar. På dag sex, ta bort 166 mikroliter medium från varje brunn och tillsätt 166 mikroliter RPMI 1640 med B27 tillägg.För detta och alla efterföljande medieförändringar, använd B27 tillägg med insulin, inkubera i ytterligare 24 timmar. På dag sju är cellkulturen redo för pro epicardial differentiering. Ta bort 166 mikroliter medium från varje brunn och tillsätt 166 mikroliter färsk RPMI 1640 som innehåller B27-tillägg och tre mikromolar cheer 99021.Sedan i inkubation i en timme, efter en timme ta bort plattan från inkubatorn, ta bort 166 mikroliter medium från ena sidan av varje brunn och tillsätt 166 mikroliter av färsk RPMI 1640 som innehåller B27-tillägg fortsätt inkubation i ytterligare 48 timmar. Upprepa denna process oss var 48: e timme fram till insamling. Organoider är redo för analyser och experiment på dag 15 För att överföra hela organoiderna, skär spetsen på en P200-pipett, fem till 10 millimeter från öppningen med en diameter på cirka två till tre millimeter.Tryck på pipettens kolv och sätt in spetsen vertikalt i den runda bottenbrunnen med organoiden. Ta upp cirka 100 till 200 mikroliter medium nog för att samla in organoiderna och överföra dem till måldestinationen. Innan differentiering EBS visas som svarta sfäriska massor börjar differentieringsprocessen på dag noll med en Wnt-vägaktivering och tillväxtfaktortillägg i exakt 24 timmar.Vidare resulterar redigeringen av Wnt C59 på dag två i utvidgningen av organoiden från cirka 200 mikrometer till högst en millimeter. De mänskliga hjärtat organoider började slå så tidigt som dag sex och 100% av organoiderna visade synlig misshandel på dag 10. Hög förstoring bilder av dag sju organoid visade att de flesta hand en uttrycker celler var kardiomyocyt i ursprung och hand två var icke myosit celler från andra Heartfield, stamceller.RNA-transkriptioner för både hand ett och hand två uttrycktes från dag tre och framåt i RNA-sekvenseringsdata. FHF markörer uttrycktes mycket under dag tre och 11 medan SF-markören uttrycktes mer efter dag 13. Immunofluorescens fläck avslöjade förekomsten av olika mänskliga hjärtcell typ härstamningar som utgör det mänskliga hjärtat.Såsom hjärtmuskel och epicardial vävnad, endokardial celler, endotelceller och hjärt fibroblast. Markörer som uttrycker ovanstående cell härstamningar observerades också i RNA SAC genuttryck profiler. Levande kalcium imaging av enskilda celler i hela organoider användes för att mäta den elektrofysiologiska funktionen hos organoiderna.Fluo-4 fluorescens intensitet varierade över tiden på grund av att kalcium inträde exit från cellen avslöjar regelbundna åtgärder potentialer. Värmekartor som visar kalciumintensiteter över en hög förstoringsregion i organoiden visar ökad intensitet på grund av kalcium transienter och enskilda celler. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att EBs och efterföljande organoider inte är fästa på botten av plattan, och vi kommer att flytta runt med borttagningen förutom media som kräver uppmärksamma medieförändringar.Organoider kan vara kultur under längre tidsperioder som introduceras till mognadstekniker, eller till och med utsätts för yttre stimuli, såsom mekanisk eller elektrisk konditionering, och till och med stressfaktorer som toxiner. Denna teknik ger som tillgång till stadier av mänsklig fetala hjärtutveckling som annars är otillgängliga i forskning, vilket banar väg för nya insikter om hjärtutveckling och sjukdom etiologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimerat protokoll för extraktion av proteiner från humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Anrikning av tvättmedel-olösligt Protein aggregat från människahjärnan efter döden

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, mänskliga celler och mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Snabb isolering av Mitoribosome från HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamisk proteomiska och miRNA analyser av Polysomes från isolerade mus hjärtat efter av Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Mänsklig mesenkymal stamcellsbearbetning för kliniska tillämpningar med hjälp av ett slutet halvautomatiserat arbetsflöde

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...