Name: generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından K01HL135464 ve R01HL151505 ödül numaraları altında ve Amerikan Kalp Derneği tarafından 19IPLOI34660342 ödül numarası altında desteklendi. MSU Farmakoloji ve Toksikoloji Bölümü'nden MSU Advanced Microscopy Core ve Dr. William Jackson'a konfokal mikroskoplara erişim için, IQ Mikroskopi Çekirdeğine ve MSU Genomik Çekirdeği'ne sıralama hizmetleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Aguirre Lab'in tüm üyelerine değerli yorumları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz.

1. hPSC kültürü ve bakımı
NOT: İnsan indüklenen PSC'ler (hiPSC'ler) veya insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler), farklılaşma veya daha fazla kriyoprezervasyon için EB üretmek için kullanılmadan önce çözdükten sonra en az 2 ardışık pasaj için kültüre edilmelidir. hPSC'ler, bodrum-membran-hücre dışı matris (BM-ECM) kaplı 6 kuyulu kültür plakalarında PSC ortamında kültürlenir ( Bkz. Malzeme Tablosu). 6 kuyulu plakalarda hPSC'lerde orta değiş...

<ol>
	<li>Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).</li><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global,+regional,+and+national+level,+1990-2017.">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), 20593 (2020).</li><li>Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+the+glass+half+empty.">Genetics of congenital heart disease: the glass half empty.</a> Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).</li><li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro.">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development.">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569, 66-72 (2019).</li><li>Mithal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchyme+free+intestinal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 11, 215 (2020).</li><li>Porotto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+modeling+of+human+respiratory+virus+infection+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+lung+organoids.">Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids.</a> mBio. 10 (3), 00723 (2019).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, 05098 (2015).</li><li>Mun, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+expandable+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocyte-like+liver+organoids.">Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids.</a> Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).</li><li>Vyas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+liver+organoids+recapitulate+hepatobiliary+organogenesis+in+vitro.">Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro.</a> Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).</li><li>Dossena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+GMP-compliant+scalable+production+of+human+pancreas+organoids.">Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11, 94 (2020).</li><li>Georgakopoulos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion,+genomic+stability+and+in+vivo+safety+of+adult+human+pancreas+organoids.">Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids.</a> BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).</li><li>Andersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precardiac+organoids+form+two+heart+fields+via+Bmp/Wnt+signaling.">Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling.</a> Nature Communications. 9, 3140 (2018).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+cardiogenesis+in+gastruloids.">Capturing cardiogenesis in gastruloids.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+functional+murine+heart+organoids+via+FGF4+and+extracellular+matrix.">In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix.</a> Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).</li><li>Drakhlis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+heart-forming+organoids+recapitulate+early+heart+and+foregut+development.">Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development.</a> Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).</li><li>Hofbauer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioids+reveal+self-organizing+principles+of+human+cardiogenesis.">Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis.</a> Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+long-term+maintenance+of+epicardial+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+under+fully+defined+conditions.">Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).</li><li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewing+human+epicardial+cells+generated+from+pluripotent+stem+cells+under+defined+xeno-free+conditions.">Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).</li><li>Lewis-Israeli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+human+heart+organoids+for+the+modeling+of+cardiac+development+and+congenital+heart+disease.">Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease.</a> Nature Communications. 12, 5142 (2021).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+Human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li><li>Hashem, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitophagy+facilitates+mitochondrial+damage+in+Danon+disease.">Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stroud, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luma+is+not+essential+for+murine+cardiac+development+and+function.">Luma is not essential for murine cardiac development and function.</a> Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+in+human+cardiac+organoids+reveals+a+metabolic+mechanism+for+cardiomyocyte+cell+cycle+arrest.">Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory.">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+plate+mesoderm:+Heart+and+Circulatory+System.">Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System.</a> Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).</li><li>Richards, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiac+organoids+for+the+modelling+of+myocardial+infarction+and+drug+cardiotoxicity.">Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).</li><li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues:+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease.">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li></ol>

İnsan kök hücre türevli kardiyomiyositler ve kardiyak kökenli diğer hücrelerdeki son gelişmeler, insan kalbi gelişimini modellemek için 22,24,25 ve hastalık26,27,28 ve terapötikleri taramak için araçlar olarak kullanılmıştır29,30 ve toksik aj...

Konjenital kalp defektleri (CHD) insanlarda en sık görülen konjenital defekt türüdür ve tüm canlı doğumların yaklaşık % 1'ini etkiler1,2,3. Çoğu durumda, CHD'lerin nedenleri bilinmemektedir. Laboratuvarda gelişmekte olan insan kalbine çok benzeyen insan kalbi modelleri oluşturma yeteneği, vekil hayvan modellerinden ziyade insanlarda CHD'lerin altında kalan nedenleri doğrudan incelemek için önemli bir adım oluşturmaktadır.
Laboratuvarda yetiştirilen doku modellerinin özeti organoidlerdir, hücre kompozisyonuna ve fizyolojik işleve ilgi gösteren bir organa benzeyen 3D hücre yapılarıdır. Organoidler genellikle kök hücrelerden veya progenitör hücrelerden türetilir ve beyin4,5, böbrek6,7, bağırsak8,9, akciğer10,11, karaciğer12,13 ve pankreas14,15 gibi birçok organı modellemek için başarıyla kullanılmıştır. , sadece birkaç isim vermek için. Son çalışmalar, kalp gelişimini in vitro olarak incelemek için kendi kendine bir araya getiren kalp organoidleri oluşturmanın fizibilitesini göstermiştir. Bu modeller, erken kalp gelişimini modellemek için fare embriyonik kök hücrelerini (mESC' ler) kullanmayı içerir16,17 atriyoventriküler spesifikasyon18'e kadar ve insan pluripotent kök hücreleri (hPSC' ler) çok mikrop tabakası kardiyak-endoderm organoidleri19 ve son derece karmaşık hücresel bileşime sahip odalı kardiyooidler20 üretmek için.
Bu makale, son derece karmaşık hMO'ları verimli ve uygun maliyetli bir şekilde oluşturmak için yeni bir 3 adımlı WNT modülasyon protokolü sunun. Organoidler 96 kuyulu plakalarda üretilir, bu da kolayca otomatikleştirilebilir ölçeklenebilir, yüksek verimli bir sistemle sonuçlanır. Bu yöntem, hPSC agregalarının oluşturulmasına ve mezoderm ve kardiyak mezoderm oluşumu, birinci ve ikinci kalp alanı spesifikasyonu, proepikardiyal organ oluşumu ve atriyoventriküler spesifikasyon dahil olmak üzere kardiyogenez gelişim adımlarını tetiklemeye dayanır. 15 günlük farklılaşmadan sonra, hNO'lar kalpte bulunan tüm ana hücre soylarını, iyi tanımlanmış iç odaları, atriyal ve ventrikül odalarını ve organoid boyunca bir damar ağını içerir. Bu son derece sofistike ve tekrarlanabilir kalp organoid sistemi, kalp gelişimi, hastalıkları ve farmakolojik tarama çalışmalarında yapısal, fonksiyonel, moleküler ve transkriptomik analizleri araştırmaya açıktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21203</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32849</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196622</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAND2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab200040</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NFAT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab25916</td>
			<td>Rabbit; 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>P2B1</td>
			<td>Rabbit; 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNNT2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td>Mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THY1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133350</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-19090</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11256</td>
			<td>Goat; 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>Rabbit; 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>NC9464543</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>338AC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (Minus Insulin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>insulin-free cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>50253966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>442310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(-)-Fructose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td>pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>410225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB40230</td>
			<td>Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>IC15014601</td>
			<td>Powder dissolved in PBS Buffer &#8211; use at 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>73155</td>
			<td>90 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>NC0729236</td>
			<td>dissociation reagent for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SML1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1525006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H170010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-C59</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>NC0710557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1495970C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>13-700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13681502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>0720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>C8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07201680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>06-666</td>
			<td>laboratory wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td>24 x 50 mm No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cell Counter</td>
			<td>Orflo Technologies</td>
			<td>&#160;MXZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Z Cell Count Cassette &#8211; Type M</td>
			<td>Orflo&#160;Technologies</td>
			<td>MXC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FBE1200300</td>
			<td>30-300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus cellVivo</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Caclium Imaging, analysis with Imagej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13-687-711PM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Coat Nail Varish</td>
			<td>Seche Vite</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from any supermarket</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells

Sağlık ve hastalıkta insan kardiyak gelişimini inceleme yeteneği, insan kalbinin in vitro karmaşıklığını modelleme kapasitesi ile oldukça sınırlıdır. Organoidler ve çip üzerindeki organlar gibi karmaşık in vivo fenotipleri modelleyebilen daha verimli organ benzeri platformlar geliştirmek, insan kalbi gelişimini ve hastalığını inceleme yeteneğini artıracaktır. Bu makalede, insan pluripotent kök hücreleri ve küçük molekül inhibitörleri kullanılarak adım adım gelişimsel yol aktivasyonu kullanılarak kendi kendine örgütlenerek son derece karmaşık insan kalbi organoidleri (hMO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Embriyoid cisimler (EBs), 96 kuyulu bir plakada yuvarlak tabanlı, ultra düşük bağlantı kuyuları ile üretilir ve bireyselleştirilmiş yapıların süspansiyon kültürünü kolaylaştırır.
EB'ler, kardiyak mezoderm kaderini teşvik etmek için ilk Wnt yolu aktivasyonunu, kesin kardiyak soylar oluşturmak için Wnt inhibisyonunun ikinci bir adımını ve proepikardiyal organ dokularını indükleyen üçüncü bir Wnt aktivasyon adımını içeren üç adımlı bir Wnt sinyal modülasyon stratejisi ile hMO'lara farklılaşmaya tabir edilir. 96 kuyu formatında gerçekleştirilen bu adımlar son derece verimli, tekrarlanabilir ve çalışma başına büyük miktarlarda organoid üretir. Farklılaşmanın 3. gününden 11. gününe kadar immünofluoresans görüntüleme ile yapılan analizler, atriyal ve ventrikül kardiyomiyosit bölgelerine sahip miyokard dokusunun yanı sıra endokardiyal doku ile kaplı iç odalar da dahil olmak üzere, 15. günde hMO'ların içindeki birinci ve ikinci kalp alanı spesifikasyonlarını ve son derece karmaşık dokuları ortaya koymaktadır. Organoidler ayrıca yapı boyunca karmaşık bir damar ağı ve epikardial dokunun dış astarını sergiler. Fonksiyonel açıdan, hMO'lar sağlam bir şekilde döver ve Fluo-4 canlı görüntüleme ile belirlenen normal kalsiyum aktivitesini sunar. Genel olarak, bu protokol insan organı benzeri kalp dokularında in vitro çalışmalar için sağlam bir platform oluşturmaktadır.

Kendi kendini organize eden hHO in vitro elde etmek, Daha önce Wnt yol modülatörleri kullanılarak kardiyomiyositlerin ve epikardiyal hücrelerin 2D monolayer farklılaşması için ve 3D prekardiyak organoidler16 için BMP4 ve Activin A. Burada açıklanan ve Şekil 1'de gösterilen 96 kuyu plakası EB ve hHO farklılaşma protokolünü kullanarak modifiye ettik ve birleştirdik. , Wnt yolu aktivatör CHIR99...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

Burada, insan pluripotent kök hücrelerini kendi kendine örgütlenerek verimli bir şekilde kullanarak gelişimsel olarak ilgili insan kalbi organoidleri (hSO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, gelişimsel ipuçlarının sıralı aktivasyonuna dayanır ve son derece karmaşık, işlevsel olarak ilgili insan kalp dokuları üretir.

Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Bu protokol, hücre hatlarında tekrarlanabilir, basit bir maliyet etkin şekilde gelişmekte olan insan kalbine yakından benzeyen karmaşık bir 3D yapı oluşturmamızı sağlar. Odalar ve vasküler ağ da dahil olmak üzere kalbin tüm hücre tiplerine yol açan üç farklılaşma adımına sahip tek bir protokolden oluşur. Bu teknik, çok çeşitli insan kardiyovasküler hastalıklarını modellememizi ve etkili farmakolojik tedavileri taramamızı sağlar.Tasarımının yüksek verimli doğası sayesinde. Bu yöntem, gelişmekte olan insan kalbinin yanı sıra yaygın olarak ilişkili hastalıkları araştırmak için yararlıdır. Bunlardan biri doğuştan kalp rahatsızlığı.Bu protokol temel hücre kültürü becerileri gerektirir. Dikkatli ve hassas pipetlemenin yanı sıra organoidlerin nazik bir şekilde kullanılmasını öneririz. Farklılaşmadan iki gün önce embriyoid cisimleri veya ÖK'ler oluşturarak başlayın.Alt bir aradaki HPSC'leri DBPS ile en az 10 saniye yıkayın. O zaman DPBS'ye talip olarak. Bir mililitre oda sıcaklığı ACUTA ekleyin ve mikroskop altında kontrol ederken, ayırmayı teşvik etmek için üç ila beş dakika boyunca her dakika yaklaşık beş kez plakaya hafifçe dokunun.Ardından reaksiyonun durdurulması için bir mililitre PSC ortamı ve Thias Avin veya Thias ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak ve hücreleri toplamak için medyayı kuyuda iki ila üç kez yukarı ve aşağı borulayın. Daha sonra tek hücreli süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve 300 kez G.Aspirate'de beş dakika döndürün ve hücreleri psc ortamı ve Thias'ın bir mililitresinde yeniden harcayın.DPBS'deki hücreleri seyreltin. Bir hücre sayacı veya hemo sistometre kullanarak hücreleri sayın ve PSC ortamındaki hücreleri Thias ile mililitre başına 100.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin. Yuvarlak bir alt ultra düşük ataşman 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.Plakayı üç dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra her kuyudan 50 mikrolitre ortayı dikkatlice çıkarın ve kuyu başına 250 mikrolitre hacim için 37 santigrat dereceye kadar ılık 200 çekirdekli taze PSC ortamı ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın.Her kuyunun bir tarafından 166 mikrolitre veya ortamın üçte ikisini çıkarın, ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca 24 saat boyunca insülinsiz B27 takviyesi, altı mikromolar cheer 990211, 0.875 nanogram kemik morfogenetik protein dört ve mililitre activin A.Incubate mililitre başına 1.5 nanogram içeren RPMI 1640 mikrolitre ekleyin. 24 saat sonra her kuyunun bir tarafından 166 mikrolitre orta çıkarın ve insülinsiz B27 takviyesi ile 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin. 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatır.İkinci günde kardiyak mezoderm spesifikasyonunu teşvik etmek için, her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve insülinsiz B27 takviyesi ve üç mikromoler Wnt-C59 içeren 166 mikrolitre RPMI 1640 ekleyin ve 48 saat boyunca inkübasyona devam edin. Dördüncü gün, her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve insülinsiz B27 takviyesi ile 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin, ardından 48 saat daha kuluçkaya yatırın. Altıncı günde, her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve B27 takviyesi ile 166 mikrolitre RPMI 1640 ekleyin.Bu ve sonraki tüm medya değişiklikleri için, insülin ile B27 takviyesi kullanın, 24 saat daha kuluçkaya yatır. Yedinci günde, hücre kültürü pro epikardial farklılaşmaya hazırdır. Her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve B27 takviyesi ve üç mikromolar cheer 99021 içeren 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin.Daha sonra bir saat kuluçkada, bir saat sonra plakayı inkübatörden çıkarın, her kuyunun bir tarafından 166 mikrolitre orta çıkarın ve B27 takviyesi içeren 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin 48 saat daha inkübasyona devam edin. Toplama işlemine kadar her 48 saatte bir bu işlemi tekrarlayın. Organoidler 15. günde analizlere ve deneylere hazırdır Tüm organoidleri aktarmak için, yaklaşık iki ila üç milimetre çapında bir P200 pipet ucunu, açıklıktan beş ila 10 milimetre kesin.Pipet pistonuna basın ve ucu organoid ile birlikte yuvarlak tabana dikey olarak yerleştirin. Organoidleri toplayacak ve hedef hedefe aktaracak kadar yaklaşık 100 ila 200 mikrolitre ortam alın. Farklılaşmadan önce EBS siyahlar küresel kütleler olarak görünmeden önce, farklılaşma süreci tam 24 saat boyunca Wnt yolu aktivasyonu ve büyüme faktörü ilavesi ile sıfır gününde başlar.Wnt C59'un ikinci günde düzenlenmesi, organoidin yaklaşık 200 mikrometreden maksimum bir milimetreye kadar genişlemesine neden olur. İnsan kalbi organoidleri altıncı gün kadar erken atmaya başladı ve organoidlerin% 100'ü 10. Yedinci günün yüksek büyütme görüntüleri organoid, çoğu el ifade hücrelerinin kökeninde kardiyomiyosit olduğunu ve el ikisinin ikinci Heartfield, progenitör hücrelerden miyosit olmayan hücreler olduğunu ortaya koydu.RNA sıralama verilerinde üçüncü günden itibaren hem birinci hem de ikinci el RNA transkriptleri ifade edilmiştir. FHF işaretleyicileri üçüncü ve 11. İmmünofluoresans lekesi, insan kalbini oluşturan çeşitli insan kalp hücresi tipi soyların varlığını ortaya koydu.Miyokard ve epikardiyal doku, endokardiyal hücreler, endotel hücreleri ve kardiyak fibroblast gibi. Yukarıdaki hücre soylarını ifade eden belirteçler RNA SAC gen ekspresyon profillerinde de gözlenmiştir. Organoidlerin elektrofizyolojik fonksiyonlarını ölçmek için tüm organoidlerdeki tek tek hücrelerin canlı kalsiyum görüntülemesi kullanılmıştır.Fluo-4 floresan yoğunluğu, düzenli eylem potansiyellerini ortaya çıkaran hücreden kalsiyum girişi çıkışı nedeniyle zamanla değişti. Organoidin yüksek bir büyütme bölgesi üzerindeki kalsiyum yoğunluklarını gösteren ısı haritaları, kalsiyum geçicileri ve bireysel hücreler nedeniyle yoğunluğun arttığını göstermektedir. Bu protokolü denerken, EBs ve sonraki organoidlerin plakanın altına bağlı olmadığını unutmayın ve özenli medya değişiklikleri gerektiren ortamlara ek olarak kaldırma işlemiyle hareket edeceğiz.Organoidler, olgunlaşma tekniklerine daha uzun süre kültür olabilir, hatta mekanik veya elektriksel şartlandırma gibi dış uyaranlara ve hatta toksinler gibi stresörlere maruz kalabilir. Bu teknik, insan fetal kalp gelişiminin araştırmalarda erişilemeyen aşamalarına erişim sağlayarak kalp gelişimi ve hastalık etiyolojisi hakkında yeni içgörülerin önünü açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow

Kapalı Yarı Otomatik İş Akışı Kullanarak Klinik Uygulamalar için İnsan Mezenkimal Kök Hücre İşleme

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are currently being explored as a promising cell-based therapeutic modality for various diseases, with more market ...