Cellebaseret terapi har et stort potentiale for hjerneregenerering. Protokollen, som vi demonstrerer her, er værdifuld, da den tillader langsgående in vivo-billeddannelse af transplanterede celler i musehjernen. Denne protokol er især nyttig til at få indsigt i migrationen og overlevelsen af transplantatet i det samme dyr over en periode.
Denne procedure kan anvendes på enhver luciferase-ekspresserende cellelinje transplanteret til musehjernen. Signalstyrken kan dog variere afhængigt af transplantationens dybde eller luciferaseekspressionen i den respektive cellelinje. Demonstration af proceduren vil være Rebecca Weber, en fremragende ph.d.-studerende i vores laboratorium.
Begynd med at samle et hætteglas med celler fra minus 150 grader Celsius opbevaring og overfør det til laboratoriet. Overfør hurtigt hætteglasset til et vandbad hærdet ved 37 grader Celsius i to til tre minutter, indtil iskrystaller opløses. Overfør derefter hætteglasset til biosikkerhedsskabet og pipetter hele indholdet i et sterilt 15 ml konisk rør.
Tilsæt ni ml steril PBS og centrifuge ved 300 G i fem minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten ved aspiration uden at forstyrre pelleten og tæl cellerne før det endelige spin ved hjælp af en automatiseret celletæller. Transporter dyret fra induktionskammeret til den stereotaxiske ramme, idet anæstesi opretholdes ved hjælp af en ansigtsmaske.
Påfør oftalmisk smøremiddel for at forhindre øjnene i at tørre ud. Barber musebunden med en elektrisk barbermaskine og desinficer huden med 5% betadinopløsning ved hjælp af vatpinde. Fastgør musehovedet og indsæt ørestængerne i den ydre meatus.
Bor et hul med en diameter på to til tre millimeter gennem kraniet med en kirurgisk tandbor. Resuspend de forberedte celler i røret og træk to mikroliter cellesuspension i en sprøjte. Placer sprøjten over målstedet og flyt langsomt nålen til overfladen af dura og beregn dybdekoordinaterne.
Dobbeltklik på living image-softwareikonet, og vælg et bruger-id på rullelisten. Klik derefter på Initialiser i det kontrolpanel, der vises. I Living Image-softwaren skal du markere felterne Selvlysende og Fotografisk i Kontrolpanel og vælge Automatisk eksponering.
Vælg et synsfelt. Indtast motivhøjden, og vælg indstillingen Brug fokus på motivhøjde. Indstil filtreringsparametrene manuelt, herunder stor binning, F / Stop, blokeret excitationsfilter og åbn emissionsfilter.
Injicer luciferin intraperitonealt, og efter fem minutter bedømdyrkes med en kontinuerlig isofluranforsyning. Barber de bedøvede dyr på hovedområdet ved hjælp af en konventionel hårbarbermaskine. Placer dyret i billedbehandlingskammeret, og start billeddannelsen 15 minutter efter luciferininjektionen ved at klikke på Hent i Kontrolpanel.
Før transplantation af neurale stamceller i musehjernen blev cellerne testet for vellykket transduktion ved ekspression af EGFP in vitro. Den vellykkede transplantation blev bekræftet af tilstedeværelsen af det røde Firefly luciferase signal. Efter transplantation af 6.000 til 180.000 celler i musens højre sensoriske motoriske cortex kunne bioluminescenssignal detekteres i alle koncentrationer.
Cellerne overlevede i mindst fem uger efter transplantationen. De transplanterede celler blev med succes påvist ex vivo i en efterfølgende histologisk analyse gennem EGFP-reporteren og immunsåbning med anti-humane kerner. Det er meget vigtigt at beregne injektionskoordinaterne omhyggeligt for at undgå at gå glip af målstedet.
Og lad også sprøjten være på plads i mindst fem minutter efter transplantationen for at undgå tilbagesvaling. Efter in vivo bioluminescerende billeddannelse kan hjernevævet enten forberedes til histologisk analyse, eller de transplanterede celler kan isoleres ved hjælp af FACS og karakteriseres med forskellige eller blandede teknologier. Samlet set giver denne teknik en kvantitativ og kontinuerlig sporing af transplanterede celler i hjernen, og den kan anvendes på et stort antal neurologiske sygdomme, herunder slagtilfælde og traumatisk hjerneskade.