La thérapie cellulaire a un énorme potentiel pour la régénération du cerveau. Le protocole que nous démontrons ici est précieux, car il permet l’imagerie longitudinale in vivo de cellules transplantées dans le cerveau de la souris. Ce protocole est particulièrement utile pour obtenir des informations sur la migration et la survie du greffon chez le même animal sur une période de temps.
Cette procédure peut être appliquée à toute lignée cellulaire exprimant la luciférase transplantée dans le cerveau de la souris. Cependant, la force du signal peut varier en fonction de la profondeur de la transplantation ou de l’expression de la luciférase dans la lignée cellulaire respective. Rebecca Weber, une excellente doctorante de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par prélever un flacon de cellules à moins 150 degrés Celsius et transférez-le au laboratoire. Transférer rapidement le flacon dans un bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes jusqu’à ce que les cristaux de glace se dissolvent. Ensuite, transférez le flacon dans l’armoire de biosécurité et pipetez tout le contenu dans un tube conique stérile de 15 millilitres.
Ajouter neuf millilitres de PBS stérile et centrifuger à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez le surnageant par aspiration sans perturber la pastille et comptez les cellules avant le spin final à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Transportez l’animal de la chambre d’induction au cadre stéréotaxique, en maintenant l’anesthésie à l’aide d’un masque facial.
Appliquez un lubrifiant ophtalmique pour empêcher les yeux de se dessécher. Rasez le cuir chevelu de la souris avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec une solution de bétadine à 5% à l’aide de cotons-tiges. Fixez la tête de la souris et insérez les barres d’oreille dans le méat externe.
Percez un trou d’un diamètre de deux à trois millimètres à travers le crâne avec une perceuse dentaire chirurgicale. Remettez en suspension les cellules préparées dans le tube et aspirez deux microlitres de suspension cellulaire dans une seringue. Placez la seringue au-dessus du site cible et déplacez lentement l’aiguille à la surface de la dure-mère et calculez les coordonnées de profondeur.
Double-cliquez sur l’icône du logiciel Living Image et sélectionnez un ID utilisateur dans la liste déroulante. Cliquez ensuite sur Initialiser dans le Panneau de configuration qui s’affiche. Dans le logiciel Living Image, cochez les cases Luminescent et Photographie dans le Panneau de configuration et sélectionnez Exposition automatique.
Sélectionnez un champ de vision. Entrez la hauteur du sujet et sélectionnez l’option Utiliser le focus sur la hauteur du sujet. Définissez manuellement les paramètres de filtrage, y compris le grand Binning, le F/Stop, le filtre d’excitation bloqué et le filtre d’émission ouvert.
Injecter la luciférine par voie intrapéritonéale et, après cinq minutes, anesthésier les animaux avec un apport continu en isoflurane. Rasez les animaux sous sédation sur la région de la tête à l’aide d’un rasoir à poils conventionnel. Placez l’animal dans la chambre d’imagerie et commencez l’imagerie 15 minutes après l’injection de luciférine en cliquant sur Acquérir dans le Panneau de configuration.
Avant de transplanter des cellules progénitrices neurales dans le cerveau de la souris, les cellules ont été testées pour une transduction réussie par expression de l’EGFP in vitro. La transplantation réussie a été confirmée par la présence du signal rouge de luciférase firefly. Après la transplantation de 6 000 à 180 000 cellules dans le cortex sensoriel-moteur droit de la souris, le signal de bioluminescence était détectable à toutes les concentrations.
Les cellules ont survécu pendant au moins cinq semaines après la transplantation. Les cellules transplantées ont été détectées avec succès ex vivo lors d’une analyse histologique ultérieure grâce au rapporteur EGFP et à l’immunocoloration avec des noyaux anti-humains. Il est très important de calculer soigneusement les coordonnées d’injection pour éviter de manquer le site cible.
Et aussi, laissez la seringue en place pendant au moins cinq minutes après la transplantation pour éviter tout reflux. Après l’imagerie bioluminescente in vivo, le tissu cérébral peut être préparé pour une analyse histologique, ou les cellules transplantées peuvent être isolées à l’aide de FACS et caractérisées avec des technologies différentes ou mixtes. Dans l’ensemble, cette technique fournit un suivi quantitatif et continu des cellules transplantées dans le cerveau, et elle peut être appliquée à un grand nombre de maladies neurologiques, y compris les accidents vasculaires cérébraux et les lésions cérébrales traumatiques.
