Cellebasert terapi har et stort potensial for hjerneregenerering. Protokollen som vi demonstrerer her er verdifull, da den tillater langsgående in vivo-avbildning av transplanterte celler i musehjernen. Denne protokollen er spesielt nyttig for å få innsikt i migrasjon og overlevelse av graftet i samme dyr over en periode.
Denne prosedyren kan brukes på en hvilken som helst luciferase-uttrykkende cellelinje transplantert til musehjernen. Signalstyrken kan imidlertid variere avhengig av dybden på transplantasjonen eller luciferaseuttrykket i den respektive cellelinjen. Å demonstrere prosedyren vil være Rebecca Weber, en utmerket ph.d.-student i vårt laboratorium.
Begynn med å samle et hetteglass med celler fra minus 150 grader Celsius lagring og overfør det til laboratoriet. Overfør raskt hetteglasset til et vannbad herdet ved 37 grader Celsius i to til tre minutter til iskrystallene oppløses. Overfør deretter hetteglasset til biosikkerhetsskapet og pipette hele innholdet til et sterilt 15 milliliter konisk rør.
Tilsett ni milliliter steril PBS og sentrifuge ved 300 G i fem minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten ved aspirasjon uten å forstyrre pelletsen og telle cellene før det endelige spinnet ved hjelp av en automatisert celleteller. Transporter dyret fra induksjonskammeret til stereotaxic rammen, opprettholde anestesi ved hjelp av en ansiktsmaske.
Påfør oftalmisk smøremiddel for å forhindre at øynene tørker ut. Barber musebunnen med en elektrisk barberhøvel og desinfiser huden med 5% betadinoppløsning ved hjelp av bomullspinne. Fest musehodet og sett ørestengene inn i den eksterne meatusen.
Bor et hull med en diameter på to til tre millimeter gjennom skallen med en kirurgisk tannbor. Resuspend de forberedte cellene i røret og trekk to mikroliter celleoppheng inn i en sprøyte. Plasser sprøyten over målstedet og beveg nålen sakte til overflaten av duraen og beregn dybdekoordinatene.
Dobbeltklikk på Living Image-programvareikonet og velg en bruker-ID fra rullegardinlisten. Klikk deretter Initialiser i Kontrollpanel som vises. Merk av for Luminescent og Fotografi i Kontrollpanel i Living Image-programvaren, og velg Automatisk eksponering.
Velg et synsfelt. Angi motivhøyden, og velg alternativet bruk motivhøydefokus. Angi filtreringsparameterne manuelt, inkludert stor binning, F/Stopp, blokkert eksitasjonsfilter og åpent utslippsfilter.
Injiser luciferin intraperitoneally, og etter fem minutter bedøv dyr med kontinuerlig isofluranforsyning. Barber de bedøvede dyrene på hodeområdet ved hjelp av en konvensjonell hår barbermaskin. Plasser dyret i bildekammeret og begynn å avbilde 15 minutter etter luciferinin-injeksjonen ved å klikke Acquire i kontrollpanelet.
Før transplantasjon av nevrale stamceller i musehjernen ble cellene testet for vellykket transduksjon ved uttrykk for EGFP in vitro. Den vellykkede transplantasjonen ble bekreftet av tilstedeværelsen av det røde Firefly luciferase-signalet. Etter transplantasjon av 6000 til 180 000 celler i høyre sensoriske motor cortex av musen, var bioluminescenssignal detekterbart i alle konsentrasjoner.
Cellene overlevde i minst fem uker etter transplantasjon. De transplanterte cellene ble vellykket oppdaget ex vivo i en påfølgende histologisk analyse gjennom EGFP-reporteren og immunostaining med antimenneskelige kjerner. Det er veldig viktig å nøye beregne injeksjonskoordinatene for å unngå å gå glipp av målstedet.
Og la også sprøyten være på plass i minst fem minutter etter transplantasjon for å unngå refluks. Etter in vivo bioluminescent avbildning kan hjernevevet enten fremstilles for histologisk analyse, eller de transplanterte cellene kan isoleres ved hjelp av FACS og karakteriseres med forskjellige eller blandede teknologier. Totalt sett gir denne teknikken en kvantitativ og kontinuerlig sporing av transplanterte celler i hjernen, og den kan brukes på et stort antall nevrologiske sykdommer, inkludert hjerneslag og traumatisk hjerneskade.