Name: the fabrication and operation of a continuous flow, micro-electroporation system with permeabilization detection
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection at JoVE.com

يود المؤلفون الاعتراف بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF CBET 0967598 ، DBI IDBR 1353918) وتدريب الخريجين التابع لوزارة التعليم الأمريكية في المجالات الناشئة للطب الدقيق والشخصي (P200A150131) لتمويل طالب الدراسات العليا JJS على الزمالة.

ملاحظة: يجب على المستخدمين مراجعة كافة MSDS للمواد والمستلزمات المستخدمة في هذا البروتوكول. يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة في كل خطوة واستخدام تقنية معقمة أثناء التجربة. تناقش الأقسام 1-7 تصنيع الجهاز.
1. تصنيع الجهاز - تصميم القناع
ملاحظة: را?...

<ol>
	<li>Gao, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+CRISPR/Cas9+gene+editing+in+engineered+T-cell+therapy.">Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy.</a> Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).</li><li>Aijaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomanufacturing+for+clinically+advanced+cell+therapies.">Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li><li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+electroporation:+A+review.">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).</li><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+and+electropermeabilization:+mechanisms+and+models.">Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models.</a> Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).</li><li>Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+electrotransfer:+A+mechanistic+perspective.">Gene electrotransfer: A mechanistic perspective.</a> Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).</li><li>Clauss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+T-cell+engineering+by+sleeping+beauty+minicircles+diminishing+DNA+toxicity+and+miRNAs+silencing+the+endogenous+T-cell+receptors.">Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors.</a> Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).</li><li>Sherba, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+electroporation+buffer+composition+on+cell+viability+and+electro-transfection+efficiency.">The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).</li><li>Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+electroporation+device+for+cell+lysis.">A microfluidic electroporation device for cell lysis.</a> Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).</li><li>Kar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation:+current+trends,+applications+and+future+prospects.">Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).</li><li>Shi, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery.">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), (2018).</li><li>Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semicontinuous+flow+electroporation+chip+for+high-throughput+transfection+on+mammalian+cells.">Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).</li><li>Wei, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+microelectrode+array+for+simultaneous+L-glutamate+and+electrophysiological+recordings+in+vivo.">An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 1, (2015).</li><li>Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+mammalian+cells+through+SiO2+thin+film+capacitive+microelectrodes.">In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes.</a> Scientific Reports. 11 (1), (2021).</li><li>Wu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-chip:+recent+breakthroughs+and+future+prospects.">Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects.</a> Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).</li><li>Pandey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Based+Point-of-Care+Diagnostics.">Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+technology+for+potential+applications+-+An+overview.">Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).</li><li>Nuxoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioMEMS+in+drug+delivery.">BioMEMS in drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).</li><li>Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+electroporation+system+for+efficient+molecular+delivery+into+Chlamydomonas+reinhardtii+with+a+3-dimensional+microelectrode.">A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamically+controlled+cell+rotation+in+an+electroporation+microchip+to+circumferentially+deliver+molecules+into+single+cells.">Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).</li><li>Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-localized+single-cell+nano-electroporation.">Nano-localized single-cell nano-electroporation.</a> Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).</li><li>Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pulse+duration+on+localized+single-cell+nano-electroporation.">Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation.</a> Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li><li>Hsi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustophoretic+rapid+media+exchange+and+continuous-flow+electrotransfection+of+primary+human+T+cells+for+applications+in+automated+cellular+therapy+manufacturing.">Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).</li><li>Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+arrays+with+real-time+monitoring+and+feedback+control.">Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).</li><li>Ye, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+and+real-time+electrical+monitoring+on+a+microfluidic+chip.">Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip.</a> 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).</li><li>Huang, Y., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+electroporation+chip+for+single+cell+membrane+permeabilization.">Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).</li><li>Guo, X. L., Zhu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+in-situ+cell+electroporation+with+cell+positioning+and+impedance+monitoring+using+micro+electrode+array.">Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+through+device+for+simultaneous+dielectrophoretic+cell+trapping+and+AC+electroporation.">A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li><li>Wang, H. Y., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+delivery+of+small+molecules+and+genes+into+cells+using+a+common+DC+power+supply.">Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).</li><li>Zheng, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+electrically-triggered,+single+cell-level+electroporation.">Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation.</a> Technology. 5 (1), 31-41 (2017).</li><li>Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+detection+methods+-+An+overview.">In vitro electroporation detection methods - An overview.</a> Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).</li><li>MICROPOSIT&#8482; S1800&#174; G2 Series Photoresists. KAYAKU Available from: <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf</a> (2021)</li><li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU Available from: <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf</a> (2001)</li><li>Substrate Preparation. MicroChemicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf">https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf</a> (2021)</li><li>Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , 91-94 (2006).</li><li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules.">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li><li>PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX Available from: <a target="_blank" href="https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf">https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf</a> (2021)</li><li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing.">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).</li></ol>

تركز المنهجية المقدمة في هذا البروتوكول بشكل أساسي على التصنيع الدقيق لجهاز الموائع الدقيقة الذي يتم دمجه بعد ذلك في إعداد تجريبي متخصص للتثقيب الكهربائي. يشير مصطلح "الوصفة" ، الذي يستخدم غالبا عند وصف تفاصيل عملية التصنيع الدقيق ، إلى أهمية اتباع / تحسين كل خطوة لتصنيع جهاز فعال بنجاح. و?...

تعتمد الابتكارات العلاجية الحالية في البحوث الطبية الحيوية ، مثل العلاج الخلوي CAR-T (الخلايا التائية المهندسة لمستقبلات المستضد الخيمري) والتحرير الجيني باستخدام CRISPR (تسلسلات الحمض النووي المتكررة القصيرة المتباعدة بانتظام / Cas9 ، بشكل كبير على القدرة على توصيل المواد الخارجية بنجاح وكفاءة إلى الفضاء داخل الخلايا1. في علاج CAR-T ، يستخدم المعيار الذهبي لأداء خطوة توصيل الجينات في تصنيع العلاج بالخلايا النواقل الفيروسية2. على الرغم من أن توصيل الجينات بوساطة فيروسية هو طريقة توصيل فعالة ، إلا أن له أيضا العديد من العيوب. وتشمل هذه تكاليف التصنيع ، والسمية الخلوية ، والمناعة ، والطفرات / إمكانية تكوين الورم ، وقيود الحجم على الجين (الجينات) التي سيتم تسليمها3. وقد أدت هذه القيود إلى البحث والتطوير لتقنيات توصيل بديلة غير فيروسية.
يعتمد التثقيب الكهربائي ، وهو بديل لتوصيل الجينات بوساطة فيروسية ، على تطبيق شكل موجة نبضة كهربائية مثالية لأداء عمليات نقل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين للخلايا. بعد تطبيق مجال كهربائي خارجي ، يتم اختراق غشاء الخلية لفترة وجيزة ، مما يجعل الخلية عرضة للتوصيل داخل الخلايا للمواد الخارجية غير المنفذةبطريقة أخرى 4. بالمقارنة مع التسليم بوساطة فيروسية ، فإن التثقيب الكهربائي مفيد لأنه آمن بشكل عام وسهل التشغيل وله تكاليف تشغيل منخفضة. يمكن أن يوفر التثقيب الكهربائي شحنات جزيئية صغيرة وكبيرة ويمكن أن يكون فعالا في نقل الخلايا بغض النظر عن النسب5. لتحقيق النتائج المرجوة بعد التثقيب الكهربائي ، أي الجدوى الجيدة وكفاءة النقل الكهربائي الجيدة ، يجب تحسين مجموعة متنوعة من المعلمات التجريبية. وتشمل هذه نوع الخلية6 ، وكثافة الخلية ، وتركيز الجزيء7 ، وخصائص المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي (على سبيل المثال ، التركيب الجزيئي ، والتوصيل ، والأسمولية) 8 ، وحجم / هندسة القطب9 ، وشكل موجة النبض الكهربائي (الشكل ، القطبية ، عدد النبضات)10 (راجع الشكل 1 للحصول على توضيح). على الرغم من أن كل من هذه المعلمات يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نتائج تجارب التثقيب الكهربائي ، فقد تمت دراسة شكل موجة النبض بشكل خاص بتفصيل كبير ، حيث أن الطاقة الكهربائية للنبضة (النبضات) المطبقة هي جذر المفاضلة الجوهرية بين قابلية بقاء الخلية الناتجة وكفاءة النقل الكهربائي8.
عادة ، يتم إجراء تجارب التثقيب الكهربائي على المقياس الكلي ، حيث يتم تعليق الخلايا في 100s من ميكرولتر من المخزن المؤقت بين مجموعة من الأقطاب الكهربائية الكبيرة المتوازية داخل كوفيت التثقيب الكهربائي. عادة ما يتم تصنيع الأقطاب الكهربائية من الألومنيوم بمسافة قطب كهربائي من 1-4 مم. بمجرد تحميل الخلايا يدويا عبر ماصة ، يتم توصيل الكوفيت كهربائيا بمولد نبض كهربائي ضخم حيث يمكن للمستخدم ضبط وتطبيق معلمات شكل موجة النبض لكهرباء تعليق الخلية. على الرغم من أن التثقيب الكهربائي على نطاق كبير أو السائبة يمكنه معالجة كثافات الخلايا >106 خلايا / مل ، إلا أن هذه الميزة يمكن أن تكون مهدرة عند تحسين إعدادات شكل موجة النبض الكهربائي. هذا مثير للقلق بشكل خاص عند استخدام أنواع الخلايا الأولية بالكهرباء حيث يمكن أن تكون أعداد الخلايا محدودة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للمسافة الكبيرة بين الأقطاب الكهربائية ، يجب أن يكون مولد النبض قادرا على توفير جهد كبير لتحقيق شدة المجال الكهربائي >1kV / cm11. تتسبب هذه الفولتية العالية في تبديد الطاقة المقاومة من خلال المخزن المؤقت للكهارل مما يؤدي إلى تسخين جول ، مما قد يضر بصلاحية الخلية الناتجة12. أخيرا ، فإن إجراء التثقيب الكهربائي على تعليق كثيف للخلايا سيكون مثقلا باستمرار بتنوع فطري في كفاءة النقل الكهربائي الناتجة وصلاحية الخلية. يمكن أن تتعرض كل خلية معلقة لشدة مجال كهربي مختلفة بسبب الخلايا المحيطة. اعتمادا على ما إذا كانت شدة المجال الكهربائي ذات الخبرة إما زيادة أو نقصان ، قد تتأثر كل من صلاحية الخلية الناتجة أو كفاءة النقل الكهربائي سلبا11. أدت هذه الجوانب السلبية للتثقيب الكهربائي على نطاق واسع إلى متابعة وتطوير تقنيات بديلة تعمل على النطاق الصغير وتسمح بتحكم أفضل على مستوى الخلية الواحدة.
ينبع مجال BioMEMS ، أو الأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة الطبية الحيوية ، من التطورات التكنولوجية التي تحققت في صناعة الإلكترونيات الدقيقة. على وجه التحديد ، استخدام عمليات التصنيع الدقيق لتطوير الأجهزة الدقيقة للنهوض بالبحوث الطبية الحيوية. تشمل هذه التطورات تطوير صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة للمراقبة الكهربائية في الجسم الحي 13 ، والأقطاب الكهربائية الدقيقة السعوية للتثقيب الكهربائي في الموقع 14 ، وأجهزة الأعضاء المصغرة على الرقاقة 15 ، وتشخيصات نقطة الرعاية للموائع الدقيقة 16 ، وأجهزة الاستشعار الحيوية 17 ، وأنظمة توصيل الأدوية18 ، بما في ذلك أجهزة التثقيب الكهربائي النانوي والدقيق 19،20،21 . نظرا للقدرة على تصميم وتصنيع الأجهزة بنفس حجم الخلايا البيولوجية ، فإن تقنيات التثقيب الكهربائي النانوي والدقيق مفيدة عند مقارنتها بنظيرتها على نطاق كلي22,23. تلغي أجهزة التثقيب الكهربائي هذه متطلبات تطبيقات نبض الجهد العالي ، حيث يتم عادة دمج مجموعات الأقطاب الكهربائية ذات المسافات من 10 إلى 100 ثانية من الميكرومتر. تقلل هذه الميزة بشكل كبير من التيار عبر المنحل بالكهرباء ، مما يقلل بدوره من تراكم منتجات التحليل الكهربائي السامة وتأثيرات تسخين جول في هذه الأنظمة. تضمن القنوات الصغيرة أيضا تطبيق مجال كهربائي أكثر اتساقا بشكل موثوق على الخلايا أثناء تطبيق النبض ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر اتساقا24. بالإضافة إلى ذلك ، من الشائع أيضا دمج أجهزة التثقيب الكهربائي الدقيقة في منصة الموائع الدقيقة التي تفسح المجال للاندماج المستقبلي في تقنية مؤتمتة بالكامل ، وهي قدرة مرغوبة للغاية في تصنيع العلاج بالخلايا25. أخيرا ، يسمح التثقيب الكهربائي على نطاق صغير بالاستجواب الكهربائي لأحداث التثقيب الكهربائي. على سبيل المثال ، يمكن مراقبة درجة نفاذية غشاء الخلية في الوقت الفعلي على مستوى خلية واحدة26,27. الغرض من هذه الطريقة هو وصف التصنيع الدقيق وتشغيل النظام وتحليل جهاز التثقيب الكهربائي الدقيق أحادي الخلية أحادي الخلية القادر على قياس درجة نفاذية غشاء الخلية لتحسين بروتوكولات التثقيب الكهربائي ، مع زيادة الإنتاجية على الحالة السابقة من بين الفن.
لم يعد إجراء التثقيب الكهربائي على مستوى الخلية الواحدة تقنية جديدة ، كما تم توضيحها لأول مرة من قبل Rubinsky et al. في عام 2001 مع تطوير تقنية التثقيب الكهربائي للخلايا الثابتة28. كان جهازهم الصغير مبتكرا لأنهم كانوا أول من أظهر القدرة على مراقبة حدث التثقيب الكهربائي كهربائيا. وقد أدى ذلك أيضا إلى تطوير تقنيات التثقيب الكهربائي الثابت أحادي الخلية القادرة على الكشف كهربائيا عن درجة نفاذية غشاء الخلية بطريقة متوازية لزيادة إنتاجية الأجهزة. ومع ذلك ، حتى مع التوازي ومعالجة الدفعات ، تفتقر هذه الأجهزة بشدة إلى العدد الإجمالي للخلايا التي يمكنها معالجتها لكل وحدة زمنية29,30. وقد أدى هذا القيد إلى تطوير أجهزة التدفق القادرة على إجراء التثقيب الكهربائي الدقيق على مستوى الخلية الواحدة عند إنتاجية أكبر بكثير31. يحد انتقال الجهاز هذا ، من البيئة الثابتة إلى بيئة التدفق ، من القدرة على المراقبة الكهربائية لدرجة نفاذية غشاء الخلية بعد تطبيق نبضة التثقيب الكهربائي. تعمل الطريقة الموصوفة في هذا العمل على سد الفجوة بين هاتين التقنيتين ، وهي تقنية تثقيب كهربائي دقيق قادرة على الكشف الكهربائي والنبض ومراقبة درجة نفاذية غشاء الخلية للخلايا الفردية ، بطريقة تسلسلية مستمرة التدفق.
تم وصف هذه التكنولوجيا مؤخرا في Zheng et al. في هذا العمل ، تم إدخال قدرات هذه التكنولوجيا مع الانتهاء من دراسة بارامترية ، حيث تم تغيير كل من سعة ومدة نبضة التثقيب الكهربائي ، وتم استكشاف الإشارة الكهربائية اللاحقة ، التي تدل على نفاذية غشاء الخلية ،32. أظهرت النتائج أن زيادة شدة نبضة التثقيب الكهربائي (أي زيادة في المجال الكهربائي المطبق أو زيادة في مدة النبضة) تسببت في زيادة نفاذية غشاء الخلية المقاسة. لمزيد من التحقق من صحة النظام ، تمت إضافة مؤشر فلوري شائع للتثقيب الكهربائي الناجح ، وهو بروبيديوم يوديد33 ، إلى تعليق الخلية ، وتم التقاط صورة مضان فور تطبيق النبضة الكهربائية. كانت الإشارة الضوئية ، أي شدة مضان يوديد البروبيديوم داخل الخلية ، مرتبطة ارتباطا وثيقا بالقياس الكهربائي لدرجة نفاذية غشاء الخلية ، مما تحقق من موثوقية هذا القياس الكهربائي. ومع ذلك ، فإن هذا العمل نظر فقط في توصيل جزيء يوديد البروبيديوم الصغير ، والذي ليس له أهمية تذكر أو معدومة.
في هذا العمل ، يتم تقديم تطبيق جديد لهذه التكنولوجيا لتحسين إنتاجية النظام مع تقديم ناقل الحمض النووي البلازميد النشط بيولوجيا (pDNA) وتقييم كفاءة النقل الكهربائي للخلايا المعاد طلاؤها وزراعتها بعد التثقيب الكهربائي. على الرغم من أن العمل السابق يتفوق على تقنيات التثقيب الكهربائي الدقيقة الحالية القادرة على قياس حدث التثقيب الكهربائي كهربائيا ، إلا أن الحالة الحالية للجهاز لا تزال تتطلب أوقات عبور طويلة للخلايا بين مجموعة القطب (~ 250 مللي ثانية) لإجراء الكشف عن الخلية وتطبيق النبض وقياس نفاذية غشاء الخلية. مع قناة واحدة ، يحد هذا من الإنتاجية إلى 4 خلايا / ثانية. لمكافحة هذا القيد ، تم تقديم مفهوم جديد للتثقيب الكهربائي الذي يتم التحكم فيه بواسطة التغذية المرتدة القائمة على الخلايا لأداء النقل الكهربائي pDNA. باستخدام المخزن المؤقت للتوصيل الكهربائي hypo-الفسيولوجية ، يسمح هذا النظام بالاستجواب الكهربائي للخلايا المفردة عبر العديد من تطبيقات نبض التثقيب الكهربائي. بناء على الاستجابة الكهربائية ، يتم بعد ذلك تحديد نبضة التثقيب الكهربائي "الأمثل". ثم يتم تنفيذ وضع "الإنتاجية العالية" حيث يتم إبطال تحديد نفاذية غشاء الخلية ، وزيادة معدل التدفق ، ومطابقة دورة عمل نبضة التثقيب الكهربائي مع وقت عبور الخلية لضمان نبضة واحدة لكل خلية أثناء النقل بين الأقطاب الكهربائية. سيوفر هذا العمل تفاصيل شاملة حول خطوات التصنيع الدقيق لتصنيع الجهاز الصغير ، والمواد / المعدات وإعدادها المطلوب لإجراء التجارب ، وتشغيل / تحليل الجهاز وكفاءة النقل الكهربائي (eTE).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg"> الشكل 1: العوامل التجريبية التي تؤثر على نتائج التثقيب الكهربائي. (يسار) تعليق الخلية - تشمل العوامل المهمة التي يجب مراعاتها قبل بدء التثقيب الكهربائي ما يلي: الحمولة الصافية (في هذه الحالة ، pDNA) ، والتركيز ، وكثافة الخلية ، وخصائص المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي. خصائص المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي التي يجب مراعاتها هي الموصلية ، الأسمولية ، والتركيب الجزيئي الدقيق الذي يساهم في هذه القيم. (وسط) تطبيق النبض - يجب تحسين نوع النبضة الدقيق (الموجة المربعة مقابل الاضمحلال الأسي) وشكل موجة النبض (النبضة المفردة مقابل قطار النبض) لزيادة كل من صلاحية الخلية الناتجة وكفاءة النقل الكهربائي. تتكون قطارات النبض الشائعة المطبقة في عمليات التثقيب الكهربائي عادة من سلسلة من نبضات الجهد العالي (HV) أو سلسلة من النبضات التي تدور بين مقادير نبضات الجهد العالي والجهد المنخفض (LV). (يمين) يجب تحسين خطوات معالجة استرداد الخلايا ، على وجه الخصوص ، وسائط ثقافة خلية الاسترداد التي يتم نقل الخلايا إليها. غير مميز (أقصى اليسار) ، يمكن تنفيذ خطوات معالجة خلايا إضافية في المنبع لتحسين عملية التثقيب الكهربائي بشكل عام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>150-mm diameter petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>step 6.1.1 to secure wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td>step 10.3.6 to plate electroporated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33220A Waveform/Function generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>step 9.2.3 electroporation pulse generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;&#39; Si-wafers</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>step 8.1.8 to plate cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td>step 2.1.2 for cleaning and&#160; step 5.1 photoresist lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-22R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2018</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>subsection 1.1. to design transparency masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etchant 10:1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td>subsection 3.1 for HF etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Monochrome microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca 285 C4742-96-12G04</td>
			<td>step 11.2.3. for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
			<td>subsection 9.3 part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Epoxy</td>
			<td>CircuitWorks</td>
			<td>CW2400</td>
			<td>subsection 7.6. for wire attachement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>step 8.1.4. for cell centrifuging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dektak 3ST Surface Profilometer</td>
			<td>Veeco (Sloan/Dektak)</td>
			<td></td>
			<td>step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable biopsy punch, 0.75 mm</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP075</td>
			<td>step 6.2.3 for inlet access</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable biopsy punch, 3 mm</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP30P</td>
			<td>step 6.2.3 for outlet access</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab108410</td>
			<td>step 11.2.2. for live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3631A Bipolar Triple DC power supply</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U Inverted&#160; Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>&#160;subsection 9.3. part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 UV Lithography System</td>
			<td>EVG</td>
			<td></td>
			<td>&#160;step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS20 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>subsection 5.1. for photoresist lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Media Bottle with Cap, 100mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB800100</td>
			<td>step 8.2.1. for buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Media Bottle with Cap, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB800500</td>
			<td>step 8.1.2.for media storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>subsection 8.1 for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>step 8.2.1 part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>379212-25ML</td>
			<td>step 2.2.3 adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI Lock-in Amplifier</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td></td>
			<td>subsection 9.2 part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2TA Current amplifier</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td></td>
			<td>subsection 9.2 part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A459-1</td>
			<td>step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>step 11.2.3 for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-20ML</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16878/1BFA 22 gauge wire</td>
			<td>AWC</td>
			<td>B22-1</td>
			<td>subsection 7.5 for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337-100G</td>
			<td>step 8.1.2 part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 319 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>10018042</td>
			<td>step 2.2.9. photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1818 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>1136925</td>
			<td>step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 x 25 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td>step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 2350 High voltage amplifier</td>
			<td>TEGAM</td>
			<td>2350</td>
			<td>step 9.2.5. part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>National Instruments LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 30G x 1 in</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>305128</td>
			<td>step 10.1.1. part of the system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA90 IC OPAMP Power circuit</td>
			<td>Digi-key</td>
			<td>598-1330-ND</td>
			<td>Part of the custom circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4458-20ML</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMAX-GFP</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>step 8.3.4. for intracellular delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing, 0.010&#39;&#39; x 0.030&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-300</td>
			<td>step 10.1.2. for system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum targets</td>
			<td>Kurt J. Lesker</td>
			<td></td>
			<td>subsection 4.2. for physical vapor deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>step 8.2.1. part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>MA1 70-2213</td>
			<td>step 10.1.4. for system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVD75 Physical vapor deposition system</td>
			<td>Kurt J. Lesker</td>
			<td></td>
			<td>subsection 4.1. for physical vapor deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PWM32 Spinner System</td>
			<td>Headway Research</td>
			<td></td>
			<td>steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-250 Plasma treatment system</td>
			<td>March Instruments</td>
			<td></td>
			<td>subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDG1025 Function/Waveform generator</td>
			<td>Siglent</td>
			<td></td>
			<td>step 9.2.2. part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>step 8.2.1. part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 negative photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111053</td>
			<td>step 2.1.7. for microfluidic channel patterning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y010200</td>
			<td>step 2.1.12. for photoresist developing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td>step 8.2.1. part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>step 6.2.1&#160; 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309628</td>
			<td>step 8.3.4. part of system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ61 Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>subsection 7.3. for channel and electrode alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Treated T25 Flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353108</td>
			<td>step 8.1.2 for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium targets</td>
			<td>Kurt J. Lesker</td>
			<td></td>
			<td>subsection 4.2. for physical vapor deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency masks</td>
			<td>CAD/ART Services</td>
			<td></td>
			<td>steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>step 6.1.2. for wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fabrication and operation of a continuous flow, micro-electroporation system with permeabilization detection

تعتمد الابتكارات العلاجية الحالية، مثل العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية، بشكل كبير على توصيل الجينات بوساطة فيروسية. على الرغم من كفاءة هذه التقنية ، إلا أنها مصحوبة بتكاليف تصنيع عالية ، مما أدى إلى الاهتمام باستخدام طرق بديلة لتوصيل الجينات. التثقيب الكهربائي هو نهج كهروفيزيائي وغير فيروسي لتوصيل الجينات والمواد الخارجية الأخرى داخل الخلايا. عند تطبيق مجال كهربائي ، يسمح غشاء الخلية مؤقتا بالتوصيل الجزيئي إلى الخلية. عادة ، يتم إجراء التثقيب الكهربائي على المقياس الكلي لمعالجة أعداد كبيرة من الخلايا. ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج تطويرا مكثفا للبروتوكول التجريبي ، وهو أمر مكلف عند العمل مع أنواع الخلايا الأولية والتي يصعب نقلها. أدى تطوير البروتوكول المطول ، إلى جانب متطلبات الفولتية الكبيرة لتحقيق شدة المجال الكهربائي الكافية لاختراق الخلايا ، إلى تطوير أجهزة التثقيب الكهربائي على نطاق صغير. يتم تصنيع أجهزة التثقيب الكهربائي الدقيقة هذه باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق الشائعة وتسمح بتحكم تجريبي أكبر مع إمكانية الحفاظ على قدرات إنتاجية عالية. يعتمد هذا العمل على تقنية التثقيب الكهربائي للموائع الدقيقة القادرة على اكتشاف مستوى نفاذية غشاء الخلية على مستوى خلية واحدة تحت التدفق المستمر. ومع ذلك ، اقتصرت هذه التقنية على 4 خلايا تمت معالجتها في الثانية ، وبالتالي تم اقتراح نهج جديد لزيادة إنتاجية النظام وتقديمه هنا. هذه التقنية الجديدة ، التي يشار إليها باسم التحكم في التغذية المرتدة القائمة على سكان الخلية ، تأخذ في الاعتبار استجابة نفاذية الخلية لمجموعة متنوعة من ظروف نبض التثقيب الكهربائي وتحدد أفضل ظروف نبض التثقيب الكهربائي لنوع الخلية قيد الاختبار. ثم يتم استخدام وضع الإنتاجية الأعلى ، حيث يتم تطبيق هذه النبضة "المثلى" على تعليق الخلية أثناء النقل. يتم عرض خطوات تصنيع الجهاز وإعداد وتشغيل تجارب الموائع الدقيقة وتحليل النتائج بالتفصيل. أخيرا ، يتم عرض تقنية التثقيب الكهربائي الدقيق هذه من خلال تقديم ترميز بلازميد الحمض النووي لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في خلايا HEK293.

يسلط الشكل 4 الضوء على مبادئ التشغيل وراء اكتشاف نفاذية الغشاء على مستوى الخلية الواحدة لسعة نبضة واحدة. بعد بدء تجربة التثقيب الكهربائي ، تحدد خوارزمية الكشف عن الخلايا عتبة مثالية للكشف عن الخلايا عبر طريقة الكشف القائمة على المنحدر نقطة تلو الأخرى. ثم يراقب النظام باست?...

Watch this Scientific Journal Video about The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection at JoVE.com

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

يصف هذا البروتوكول تقنيات التصنيع الدقيق المطلوبة لبناء جهاز التثقيب الكهربائي للميكروفلويديك على رقاقة. يقوم الإعداد التجريبي بإجراء عمليات نقل على مستوى خلية واحدة خاضعة للرقابة في تدفق مستمر ويمكن تمديدها إلى إنتاجية أعلى مع التحكم القائم على السكان. يتم توفير تحليل يوضح القدرة على مراقبة درجة نفاذية غشاء الخلية كهربائيا في الوقت الفعلي.

تصنيع وتشغيل التدفق المستمر ، نظام التثقيب الكهربائي الدقيق مع كشف النفاذية

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

تسمح هذه الطريقة للباحثين بتحديد الظروف المثلى لنبض التثقيب الكهربائي لنوع الخلية المطلوب ، مع تقليل الحاجة إلى النهج التجريبي التجريبي التقليدي. تستخدم هذه الطريقة تقنيات التثقيب الكهربائي الدقيق لتصنيع جهاز تشغيل الموائع الدقيقة القابل للتطوير والقادر على مراقبة درجة نفاذية غشاء الخلية كهربائيا طوال عملية التثقيب الكهربائي. سيوضح الإجراء كيشانكومار بوشا ، طالب ماجستير من مختبري.للبدء ، قم بتثبيت رقاقة السيليكون في ظرف طلاء دوران الرقاقة باستخدام نظام تفريغ مغلف الدوران. ثم قم ببرمجة الدوار. بعد ذلك ، قم بتوزيع أربعة ملليلتر من مقاومة الصور SU-8 2010 على مركز رقاقة السيليكون وقم بتشغيل البرنامج.بمجرد توقف النظام ، قم بإيقاف تشغيل الفراغ. ثم قم بتأمين قناع الصورة بتصميمات قناة الموائع الدقيقة 2D على حامل القناع وأدخل رقاقة السيليكون مع طلاء SU-8 متجها لأعلى على ظرف الرقاقة. اضبط إعدادات التعريض الضوئي ل 150 مللي جول لكل سنتيمتر مربع وقم بتشغيل الجهاز.بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، اغمر رقاقة السيليكون في محلول مطور SU-8 مع تحريض لطيف لمدة ثلاث إلى أربع دقائق. ثم قم بإزالة الرقاقة من المحلول وشطف السطح باستخدام الأيزوبروبانول. بعد ذلك ، ضع رقاقة السيليكون في فرن 150 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للخبز الصلب.ثم اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدام قياس ملامح القلم لقياس الارتفاع والانحدار الدقيق للجدران الجانبية للقناة. بعد ذلك ، قم بتوزيع ملليلتر واحد من مقاومة الصور على سطح الشريحة الزجاجية وقم بتشغيل البرنامج مرة أخرى. بمجرد توقف النظام ، قم بإيقاف تشغيل الفراغ وإزالة الشريحة الزجاجية.بعد تأمين قناع الصورة بتصميمات القطب 2D على حامل القناع ، أدخل الرقاقة الزجاجية وقم بمحاذاتها مع طلاء S-1818 المواجه لأعلى على ظرف الرقاقة. اضبط إعدادات التعريض الضوئي على 215 مللي جول لكل سنتيمتر مربع وقم بتشغيل الجهاز. بعد التعرض ، غمر الشريحة الزجاجية في حل مطور MF-319 لمدة دقيقتين ، مع تطبيق التحريض اللطيف.ثم قم بإزالة الرقاقة الزجاجية وشطف سطحها بالماء منزوع الأيونات. أخيرا ، ضع الشريحة الزجاجية في فرن 150 درجة مئوية للخبز الصلب ، مما يضمن أن سطح الركائز محل الاهتمام متجها لأعلى. بعد 30 دقيقة ، أخرج الشريحة من الفرن وحمايتها من الضوء.لحفر الشريحة الزجاجية ، قم بغمرها في محلول حمض الهيدروفلوريك المخزن من 10 إلى 1 لمدة دقيقة واحدة في حاوية بولي تترافلورو إيثيلين. ثم انقل وغسل الشرائح الزجاجية في ماء منزوع الأيونات ثلاث مرات. بعد ذلك ، باستخدام نظام ترسيب البخار المادي ، يقوم برش التيتانيوم لمدة ثماني دقائق بمعدل 100 أنغستروم في الدقيقة والبلاتين لمدة 10 دقائق بمعدل 200 أنغستروم في الدقيقة.ثم لرفع مقاومة الصورة ، اغمر الشرائح الزجاجية المطلية بالمعدن في حمام الأسيتون لمدة 10 دقائق وقم بصوتنة الحمام لإدخال الإثارة. إذا لزم الأمر ، استخدم منديلا منقوعا بالأسيتون لإزالة أي بقايا. التالي لصب نسخة طبق الأصل polydimethylsiloxane يجعل قاعدة المطاط الصناعي PDMS مع مادة صلبة بنسبة وزن 10 إلى 1 في حاوية يمكن التخلص منها موضوعة فوق ميزان إلكتروني.ثم صب محلول PDMS فوق رقاقة السيليكون ووضع الخليط تحت فراغ لإزالة فقاعات الهواء. بعد معالجة الخليط عند 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن أربع ساعات ، استخدم طرف شفرة الحلاقة لقطع PDMS المصبوب وتقشيره من رقاقة السيليكون. ثم باستخدام لكمة خزعة حادة ، قم بإزالة PDMS من مدخل ومنافذ الجهاز.بعد ذلك ، قم ببرمجة مولد البلازما لربط PDMS. ثم ضع PDMS وشريحة زجاج القطب في النظام مع توجيه الميزات لأعلى وتشغيل البرنامج. بعد اكتمال البرنامج ، قم بإزالة الأجهزة واستخدم مجسما لمحاذاة ميزات القناة بسرعة مع الأقطاب الكهربائية.قم بالضغط بقوة من مركز PDMS باتجاه الجانبين لإزالة أي فقاعات هواء غير مرغوب فيها في واجهة الترابط. حصاد خلايا HEK293 ، وطردها بالطرد المركزي ، وإعادة تعليق الحبيبات في مخزن التثقيب الكهربائي عند ما يقرب من خمسة ملايين خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ترميز الحمض النووي للبلازما ل GFP إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغرام لكل ملليلتر واخلطه بلطف.ثم نقل تعليق خلية البلازما الحمض النووي إلى حقنة سنتيمتر مكعب واحد للتجريب. ضع الجهاز الصغير على مرحلة المجهر عبر حامل منزلق. ثم قم بتشغيل الجهاز المقترن المشحون ، وكاميرا CCD ، وقم بتركيز قناة الموائع الدقيقة.بعد ذلك للتثقيب الكهربائي أحادي الخلية ، اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة على 0.1 إلى 0.3 ميكرولتر في الدقيقة لضمان تدفق الخلايا المفردة عبر مجموعة القطب. ثم اضبط معلمات النبض لنبضة التثقيب الكهربائي الأولية والأدنى للطاقة الكهربائية. اتبع عددا محددا مسبقا من اكتشافات الخلايا لكل تطبيق نبض.في نهاية كل حالة تم اختبارها ، قم بشفط الخلايا من منفذ الجهاز الصغير وقم بتجديد المخرج بوسائط الاسترداد. كرر إلى حالة نبض التثقيب الكهربائي التالية وكرر حتى يتم اختبار جميع ظروف نبض التثقيب الكهربائي. بعد ذلك ، حدد معلمات نبض التثقيب الكهربائي للحصول على ردود فعل عالية الإنتاجية تستند إلى السكان.بالنسبة للتثقيب الكهربائي الذي يتم التحكم فيه بالتغذية المرتدة على السكان ، اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة على واحد إلى ثلاثة ميكرولتر في الدقيقة واضبط سعة النبضة على الحالة المثلى. ثم قم بإيقاف تشغيل وضع التشغيل واضبط عرض النبضة ليتناسب مع وقت عبور الخلية. بعد أن يتم شحن العدد المطلوب من الخلايا بالكهرباء ، قم بإيقاف تشغيل كل من مضخة المحاقن ومولد الوظيفة.ثم انقل الخلايا من خزان المخرج إلى دورق أو صفيحة زراعة خلية بحجم مناسب مملوءة بوسائط استرداد دافئة مسبقا وانقل قارورة أو صفيحة الثقافة إلى حاضنة. لتحليل البيانات ، قم بتحميل البيانات في برنامج تحليل وإنشاء مخطط للتيار مقابل الوقت لكل حالة نابضة. ثم حدد درجة نفاذية غشاء الخلية ، وقم بإنشاء خريطة نفاذية غشاء الخلية على جميع ظروف النبض المختبرة ، وتحقق من حالة النبض المثلى.بعد الحضانة ، التقط صورا مضان باستخدام FITC والمرشحات الحمراء البعيدة ، وقم بتحليل مجموعات الصور يدويا أو عبر خوارزمية. يتم تسليط الضوء هنا على مبادئ التشغيل وراء اكتشاف نفاذية مستوى الخلية المفردة لسعة نبضة واحدة. بعد كل معلمة نبضة التثقيب الكهربائي ، يتم اختبار نبضة التثقيب الكهربائي التالية الأعلى طاقة.أظهرت خريطة نفاذية غشاء الخلية لخلايا HEK293 ارتباطا واضحا بين الطاقة الكهربائية المطبقة ودرجة نفاذية غشاء الخلية. في هذه التجربة ، تم تحديد شدة المجال الكهربائي البالغة 1.8 كيلو فولت لكل سنتيمتر ونبضة 670 ميكروثانية على أنها الأمثل. عند هذه القيم ، تم تحقيق كفاءة نقل كهربائي بنسبة 70٪.على النقيض من شدة المجال الكهربائي البالغة 0.4 كيلو فولت لكل سنتيمتر ومدة نبضة ثلاثة مللي ثانية ، كانت كفاءة النقل الكهربائي في 24 ساعة أقل من 5٪ مصطلح الوصفة ، والذي يستخدم غالبا عند وصف محدد لعملية التصنيع الدقيقة ، أدخل أهمية اتباع أو تحسين كل خطوة لتصنيع جهاز فعال بنجاح. يمكن استخدام تقنية التثقيب الكهربائي هذه في مشاريع بحثية طبية حيوية إضافية مثل توليد واختبار الخلايا التائية CAR T أو تحسين واختبار تقنيات تحرير الجينات CRISPR-Cas9. تسمح تقنية التثقيب الكهربائي الدقيق هذه بالاستجواب الكهربائي لاستجابات أنواع الخلايا المختلفة لتطبيق ظروف النبض الكهربائي وربط تلك المعلومات بتسليم البضائع الجزيئية ذات الصلة سريريا.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

تصنيع ميكروفلويديك من الألياف البوليمرية والحيوية مع الحجم والشكل المصمم مسبقا

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

الطباعة المغمورة من خلايا على سطح معدلة باستخدام التدفق المستمر Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

سريع المعالجة الأنزيمية من البروتينات للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد مع Microreactor التدفق من خلال

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...