Name: the fabrication and operation of a continuous flow, micro-electroporation system with permeabilization detection
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende økonomisk støtte fra National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) og US Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) til finansiering af kandidatstuderende JJS på stipendium.

BEMÆRK: Brugere bør gennemgå alle MSDS for de materialer og forsyninger, der anvendes i denne protokol. Der skal bæres passende personlige værnemidler på hvert trin, og steril teknik skal anvendes under forsøg. Afsnit 1-7 diskuterer enhedens fabrikation.
1. Enhedsfremstilling - Maskedesign
BEMÆRK: Se figur 2 for en illustration af mikrofabrikationsprocessen. Mikrofabrikationstrinnene skal udføres i et renrumsmilj...

<ol>
	<li>Gao, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+CRISPR/Cas9+gene+editing+in+engineered+T-cell+therapy.">Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy.</a> Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).</li><li>Aijaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomanufacturing+for+clinically+advanced+cell+therapies.">Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).</li><li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+lentiviral+vectors.">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li><li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+electroporation:+A+review.">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).</li><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+and+electropermeabilization:+mechanisms+and+models.">Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models.</a> Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).</li><li>Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+electrotransfer:+A+mechanistic+perspective.">Gene electrotransfer: A mechanistic perspective.</a> Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).</li><li>Clauss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+T-cell+engineering+by+sleeping+beauty+minicircles+diminishing+DNA+toxicity+and+miRNAs+silencing+the+endogenous+T-cell+receptors.">Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors.</a> Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).</li><li>Sherba, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+electroporation+buffer+composition+on+cell+viability+and+electro-transfection+efficiency.">The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency.</a> Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).</li><li>Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+electroporation+device+for+cell+lysis.">A microfluidic electroporation device for cell lysis.</a> Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).</li><li>Kar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation:+current+trends,+applications+and+future+prospects.">Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).</li><li>Shi, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+electroporation-based+intracellular+delivery.">A review on electroporation-based intracellular delivery.</a> Molecules. 23 (11), (2018).</li><li>Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semicontinuous+flow+electroporation+chip+for+high-throughput+transfection+on+mammalian+cells.">Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).</li><li>Wei, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+microelectrode+array+for+simultaneous+L-glutamate+and+electrophysiological+recordings+in+vivo.">An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 1, (2015).</li><li>Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+mammalian+cells+through+SiO2+thin+film+capacitive+microelectrodes.">In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes.</a> Scientific Reports. 11 (1), (2021).</li><li>Wu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-chip:+recent+breakthroughs+and+future+prospects.">Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects.</a> Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).</li><li>Pandey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+Based+Point-of-Care+Diagnostics.">Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).</li><li>Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+technology+for+potential+applications+-+An+overview.">Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).</li><li>Nuxoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioMEMS+in+drug+delivery.">BioMEMS in drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).</li><li>Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+electroporation+system+for+efficient+molecular+delivery+into+Chlamydomonas+reinhardtii+with+a+3-dimensional+microelectrode.">A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamically+controlled+cell+rotation+in+an+electroporation+microchip+to+circumferentially+deliver+molecules+into+single+cells.">Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).</li><li>Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-localized+single-cell+nano-electroporation.">Nano-localized single-cell nano-electroporation.</a> Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).</li><li>Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pulse+duration+on+localized+single-cell+nano-electroporation.">Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation.</a> Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li><li>Hsi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustophoretic+rapid+media+exchange+and+continuous-flow+electrotransfection+of+primary+human+T+cells+for+applications+in+automated+cellular+therapy+manufacturing.">Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).</li><li>Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+arrays+with+real-time+monitoring+and+feedback+control.">Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).</li><li>Ye, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+and+real-time+electrical+monitoring+on+a+microfluidic+chip.">Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip.</a> 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).</li><li>Huang, Y., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+electroporation+chip+for+single+cell+membrane+permeabilization.">Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).</li><li>Guo, X. L., Zhu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+in-situ+cell+electroporation+with+cell+positioning+and+impedance+monitoring+using+micro+electrode+array.">Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+through+device+for+simultaneous+dielectrophoretic+cell+trapping+and+AC+electroporation.">A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li><li>Wang, H. Y., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+delivery+of+small+molecules+and+genes+into+cells+using+a+common+DC+power+supply.">Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).</li><li>Zheng, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous-flow,+electrically-triggered,+single+cell-level+electroporation.">Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation.</a> Technology. 5 (1), 31-41 (2017).</li><li>Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electroporation+detection+methods+-+An+overview.">In vitro electroporation detection methods - An overview.</a> Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).</li><li>MICROPOSIT&#8482; S1800&#174; G2 Series Photoresists. KAYAKU Available from: <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf</a> (2021)</li><li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU Available from: <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf</a> (2001)</li><li>Substrate Preparation. MicroChemicals Available from: <a target="_blank" href="https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf">https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf</a> (2021)</li><li>Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , 91-94 (2006).</li><li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules.">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li><li>PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX Available from: <a target="_blank" href="https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf">https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf</a> (2021)</li><li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing.">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).</li></ol>

Metoden, der præsenteres inden for denne protokol, fokuserer primært på mikrofabrikation af en mikrofluidisk enhed, der derefter integreres i en specialiseret elektroporationseksperimentel opsætning. Udtrykket 'opskrift', som ofte bruges, når man beskriver detaljerne i mikrofabrikationsprocessen, antyder vigtigheden af at følge / optimere hvert trin for at kunne fremstille en fungerende enhed. Imidlertid kan visse kritiske trin i processen, når de ikke er optimeret, såsom UV-eksponeringstid / energi, PVD-forstøv...

Nuværende terapeutiske innovationer inden for biomedicinsk forskning, såsom CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T-celle) celleterapi og genetisk redigering ved hjælp af CRISPR (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagne DNA-sekvenser) / Cas9, er stærkt afhængige af evnen til at levere eksogent materiale både med succes og effektivt ind i det intracellulære rum1. I CAR-T-terapi er guldstandarden til at udføre genleveringstrinnet i fremstilling af celleterapi ved hjælp af virale vektorer2. Selvom viral-medieret genlevering er en effektiv leveringsmodalitet, har den også flere ulemper. Disse omfatter produktionsomkostninger, cytotoksicitet, immunogenicitet, mutagenese / tumorigenesepotentiale og størrelsesbegrænsninger på det eller de gener, der skal leveres3. Disse begrænsninger har ført til forskning og udvikling af alternative, ikke-virale leveringsteknologier.
Elektroporation, et alternativ til viral-medieret genlevering, er afhængig af anvendelsen af en optimal elektrisk pulsbølgeform til at udføre DNA-, RNA- og proteintransfektioner af celler. Efter påføring af et eksternt elektrisk felt kompromitteres cellemembranen kortvarigt, hvilket gør cellen modtagelig for intracellulær levering af ellers uigennemtrængelige eksogene materialer4. Sammenlignet med viral-medieret levering er elektroporation fordelagtig, da den generelt er sikker, nem at betjene og har lave driftsomkostninger. Elektroporation kan levere både lille og stor molekylær last og kan være effektiv til at transficere celler uanset afstamning5. For at opnå ønskelige resultater efter elektroporation, dvs. god levedygtighed og god elektrotransfektionseffektivitet, skal en række eksperimentelle parametre samoptimeres. Disse omfatter celletype6, celletæthed, molekylekoncentration7, elektroporationsbufferegenskaber (f.eks. molekylær sammensætning, ledningsevne og osmolaritet)8, elektrodestørrelse/geometri9 og elektrisk pulsbølgeform (form, polaritet, antal impulser)10 (se figur 1 for en illustration). Selvom hver af disse parametre kan have en signifikant effekt på resultaterne af elektroporationseksperimenter, er pulsbølgeform især blevet undersøgt i detaljer, da den elektriske energi i den eller de anvendte impulser er roden til den iboende afvejning mellem den resulterende cellelevedygtighed og elektrotransfektionseffektivitet8.
Typisk udføres elektroporationseksperimenter på makroskalaen, hvor celler suspenderes i 100'erne mikroliter buffer mellem et sæt store parallelpladeelektroder i en elektroporationskuvette. Elektroderne fremstilles almindeligvis af aluminium med en elektrodeafstand på 1-4 mm. Når cellerne er manuelt indlæst via pipette, er kuvetten elektrisk forbundet til en omfangsrig, elektrisk pulsgenerator, hvor brugeren kan indstille og anvende pulsbølgeformparametrene til at elektropolere cellesuspensionen. Selvom makroskala eller bulkelektroporation kan behandle celletætheder >106 celler / ml, kan denne funktion være spildt, når du optimerer indstillingerne for elektrisk pulsbølgeform. Dette er især bekymrende ved elektropering af primære celletyper, hvor cellepopulationstallene kan begrænses. På grund af den store afstand mellem elektroderne skal pulsgeneratoren desuden være i stand til at levere store spændinger for at opnå elektriske feltstyrker >1kV / cm11. Disse høje spændinger forårsager resistiv effektafledning gennem elektrolytbufferen, hvilket resulterer i Joule-opvarmning, hvilket kan være skadeligt for den resulterende cellelevedygtighed12. Endelig vil udførelse af elektroporation på en tæt suspension af celler konsekvent blive belastet med en medfødt variabilitet i den resulterende elektrotransfektionseffektivitet og cellelevedygtighed. Hver celle i suspension kunne opleve en anden elektrisk feltstyrke på grund af de omgivende celler. Afhængigt af om den erfarne elektriske feltstyrke enten øges eller formindskes, kan den resulterende cellelevedygtighed eller elektrotransfektionseffektivitet hver især blive negativt påvirket11. Disse ulemper ved elektroporation i makroskala har ført til forfølgelse og udvikling af alternative teknologier, der opererer på mikroskala og giver mulighed for bedre kontrol på enkeltcelleniveau.
Området BioMEMS eller biomedicinske mikroelektromekaniske systemer stammer fra de teknologiske fremskridt, der er gjort i mikroelektronikindustrien. Specifikt ved hjælp af mikrofabrikationsprocesser til udvikling af mikroenheder til fremme af biomedicinsk forskning. Disse fremskridt omfatter udvikling af mikroelektrodearrays til in vivo elektrisk overvågning 13, kapacitive mikroelektroder til in situ-elektroporation14, miniaturiserede organ-on-a-chip-enheder 15, mikrofluidisk point-of-care-diagnostik 16, biosensorer 17 og lægemiddelafgivelsessystemer 18, herunder nano- og mikroelektroporationsenheder 19,20,21 . På grund af evnen til at designe og fremstille enheder i samme størrelsesskala som biologiske celler er nano- og mikroelektroporationsteknologier fordelagtige sammenlignet med deres makroskala modstykke22,23. Disse elektroporationsenheder eliminerer kravet om højspændingspulsapplikationer, da elektrodesæt med afstande fra 10'erne til 100'erne mikrometer typisk er integreret. Denne funktion reducerer strømmen drastisk gennem elektrolytten, hvilket igen reducerer akkumuleringen af giftige elektrolyseprodukter og virkningerne af Joule-opvarmning i disse systemer. Mikroskalakanalerne sikrer også, at et meget mere ensartet elektrisk felt pålideligt påføres cellerne under pulspåføring, hvilket resulterer i mere ensartede resultater24. Derudover er det også almindeligt, at mikroelektroporationsanordninger integreres i en mikrofluidisk platform, der egner sig til fremtidig integration i en fuldautomatisk teknologi, en meget ønskelig kapacitet inden for fremstilling af celleterapi25. Endelig giver mikroskala elektroporation mulighed for elektrisk forhør af elektroporationshændelser. For eksempel kan graden af cellemembranpermeabilisering overvåges i realtid på et enkelt celleniveau26,27. Formålet med denne metode er at beskrive mikrofabrikation, systemdrift og analyse af en mikrofluid, enkeltcellet mikroelektroporationsenhed, der er i stand til at måle graden af cellemembranpermeabilisering til optimering af elektroporationsprotokoller, men alligevel øge gennemstrømningen i forhold til den tidligere state-of-the-art.
Udførelse af elektroporation på enkeltcelleniveau er ikke længere en ny teknik, som det først blev demonstreret af Rubinsky et al. i 2001 med udviklingen af en statisk celleelektroporationsteknologi28. Deres mikroenhed var innovativ, da de var de første til at demonstrere evnen til elektrisk at overvåge elektroporationsbegivenheden. Dette har yderligere ført til udviklingen af statiske, enkeltcellede elektroporationsteknologier, der er i stand til elektrisk at detektere graden af cellemembranpermeabilisering på en paralleliseret måde for at øge enhedernes gennemstrømning. Men selv med parallelisering og batchbehandling mangler disse enheder alvorligt det samlede antal celler, de kan behandle pr. Tidsenhed29,30. Denne begrænsning har ført til udviklingen af gennemstrømningsenheder, der er i stand til at udføre mikroelektroporation på enkeltcelleniveau ved meget større gennemstrømninger31. Denne enhedsovergang fra statisk til gennemstrømningsmiljø begrænser evnen til elektrisk overvågning af graden af cellemembranpermeabilisering efter påføring af elektroporationspulsen. Metoden beskrevet i dette arbejde bygger bro mellem disse to teknologier, en mikroelektroporationsteknologi, der er i stand til elektrisk at detektere, pulsere og overvåge graden af cellemembranpermeabilisering af individuelle celler på en kontinuerlig flow, seriel måde.
Denne teknologi blev for nylig beskrevet i Zheng et al. I dette arbejde blev kapaciteten af denne teknologi introduceret med afslutningen af en parametrisk undersøgelse, hvor både amplituden og varigheden af elektroporationspulsen blev varieret, og det efterfølgende elektriske signal, der tyder på cellemembranpermeabilisering, blev undersøgt32. Resultaterne viste, at en stigning i intensiteten af elektroporationspulsen (dvs. stigning i påført elektrisk felt eller stigning i pulsvarighed) forårsagede en stigning i den målte cellemembranpermeabilisering. For yderligere at validere systemet blev en fælles fluorescerende indikator for vellykket elektroporation, propidiumiodid33, tilsat cellesuspensionen, og et fluorescensbillede blev taget umiddelbart efter påføringen af den elektriske puls. Det optiske signal, dvs. fluorescensintensiteten af propidiumiodid inde i cellen, var stærkt korreleret med den elektriske måling af graden af cellemembranpermeabilisering, hvilket verificerede pålideligheden af denne elektriske måling. Dette arbejde overvejede imidlertid kun levering af det lille molekyle propidiumiodid, som har ringe eller ingen oversættelig betydning.
I dette arbejde introduceres en ny anvendelse af denne teknologi for at forbedre systemets gennemstrømning, samtidig med at der leveres en biologisk aktiv plasmid-DNA (pDNA) vektor og vurderer elektrotransfektionseffektiviteten af celler, der replateres og dyrkes efter elektroporation. Selvom det tidligere arbejde overgår eksisterende mikroelektroporationsteknologier, der er i stand til elektrisk at måle elektroporationsbegivenheden, kræver enhedens aktuelle tilstand stadig lange celletransittider mellem elektrodesættet (~ 250 ms) for at udføre celledetektion, pulsapplikation og måling af cellemembranpermeabilisering. Med en enkelt kanal begrænser dette gennemstrømningen til 4 celler/s. For at bekæmpe denne begrænsning introduceres et nyt koncept for cellepopulationsbaseret feedback-kontrolleret elektroporation for at udføre pDNA-elektrotransfektion. Ved at bruge en hypofysiologisk ledningsevne elektroporationsbuffer giver dette system mulighed for elektrisk forhør af enkeltceller på tværs af en lang række elektroporationspulsapplikationer. Baseret på det elektriske respons bestemmes derefter en 'optimal' elektroporationspuls. En 'high-throughput' -tilstand implementeres derefter, hvor cellemembranpermeabiliseringsbestemmelsen ophæves, strømningshastigheden øges, og elektroporationspulsens driftscyklus matches med celletransittiden for at sikre en puls pr. celle i transit mellem elektroderne. Dette arbejde vil give omfattende detaljer om mikrofabrikationstrinnene til fremstilling af mikroenheden, materialet / udstyret og deres opsætning, der kræves for at udføre eksperimenteringen, og driften / analysen af enheden og dens elektrotransfektionseffektivitet (eTE).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg"> Figur 1: Eksperimentelle faktorer, der påvirker elektroporationsresultater. (Venstre) Cellesuspension-Vigtige faktorer, der skal overvejes inden elektroporationens begyndelse, omfatter: Nyttelast (i dette tilfælde pDNA), koncentration, celletæthed og elektroporationsbufferegenskaber. Elektroporationsbufferegenskaber, der skal overvejes, er ledningsevne, osmolaritet og den nøjagtige molekylære sammensætning, der bidrager til disse værdier. (Midten) Pulsapplikation-Den nøjagtige pulstype (kvadratbølge vs. eksponentielt henfald) og pulsbølgeform (enkelt puls vs. pulstog) skal optimeres for at maksimere både den resulterende cellelevedygtighed og elektrotransfektionseffektivitet. Almindelige pulstog implementeret i elektroporationsprocesser består typisk af en række højspændingsimpulser (HV) eller serier af impulser, der roterer mellem HV og lavspændings (LV) pulsstørrelser. (Højre) Cell Recovery-Down-stream behandlingstrin, især gendannelsescellekulturmediet, som celler overføres til, bør optimeres. Ikke fremhævet (yderst til venstre), yderligere opstrøms cellebehandlingstrin kan implementeres til samlet optimering af elektroporationsprocessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>150-mm diameter petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>step 6.1.1 to secure wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td>step 10.3.6 to plate electroporated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33220A Waveform/Function generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>step 9.2.3 electroporation pulse generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;&#39; Si-wafers</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>step 8.1.8 to plate cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td>step 2.1.2 for cleaning and&#160; step 5.1 photoresist lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-22R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2018</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>subsection 1.1. to design transparency masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered oxide etchant 10:1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>901621-1L</td>
			<td>subsection 3.1 for HF etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Monochrome microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca 285 C4742-96-12G04</td>
			<td>step 11.2.3. for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
			<td>subsection 9.3 part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive Epoxy</td>
			<td>CircuitWorks</td>
			<td>CW2400</td>
			<td>subsection 7.6. for wire attachement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>step 8.1.4. for cell centrifuging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dektak 3ST Surface Profilometer</td>
			<td>Veeco (Sloan/Dektak)</td>
			<td></td>
			<td>step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable biopsy punch, 0.75 mm</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP075</td>
			<td>step 6.2.3 for inlet access</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable biopsy punch, 3 mm</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP30P</td>
			<td>step 6.2.3 for outlet access</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab108410</td>
			<td>step 11.2.2. for live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3631A Bipolar Triple DC power supply</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TE2000-U Inverted&#160; Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>&#160;subsection 9.3. part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVG620 UV Lithography System</td>
			<td>EVG</td>
			<td></td>
			<td>&#160;step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>FBS001</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS20 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>subsection 5.1. for photoresist lift-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Media Bottle with Cap, 100mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB800100</td>
			<td>step 8.2.1. for buffer storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Media Bottle with Cap, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB800500</td>
			<td>step 8.1.2.for media storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>subsection 8.1 for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>step 8.2.1 part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>379212-25ML</td>
			<td>step 2.2.3 adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2LI Lock-in Amplifier</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td></td>
			<td>subsection 9.2 part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF2TA Current amplifier</td>
			<td>Zurich Instruments</td>
			<td></td>
			<td>subsection 9.2 part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A459-1</td>
			<td>step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>step 11.2.3 for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513-20ML</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16878/1BFA 22 gauge wire</td>
			<td>AWC</td>
			<td>B22-1</td>
			<td>subsection 7.5 for device fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337-100G</td>
			<td>step 8.1.2 part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 319 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>10018042</td>
			<td>step 2.2.9. photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1818 photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>1136925</td>
			<td>step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 75 x 25 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td>step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 2350 High voltage amplifier</td>
			<td>TEGAM</td>
			<td>2350</td>
			<td>step 9.2.5. part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>National Instruments LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 30G x 1 in</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>305128</td>
			<td>step 10.1.1. part of the system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA90 IC OPAMP Power circuit</td>
			<td>Digi-key</td>
			<td>598-1330-ND</td>
			<td>Part of the custom circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4458-20ML</td>
			<td>step 8.1.2. part of media composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMAX-GFP</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>step 8.3.4. for intracellular delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing, 0.010&#39;&#39; x 0.030&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89404-300</td>
			<td>step 10.1.2. for system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum targets</td>
			<td>Kurt J. Lesker</td>
			<td></td>
			<td>subsection 4.2. for physical vapor deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>step 8.2.1. part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>MA1 70-2213</td>
			<td>step 10.1.4. for system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVD75 Physical vapor deposition system</td>
			<td>Kurt J. Lesker</td>
			<td></td>
			<td>subsection 4.1. for physical vapor deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PWM32 Spinner System</td>
			<td>Headway Research</td>
			<td></td>
			<td>steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX-250 Plasma treatment system</td>
			<td>March Instruments</td>
			<td></td>
			<td>subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDG1025 Function/Waveform generator</td>
			<td>Siglent</td>
			<td></td>
			<td>step 9.2.2. part of the experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>step 8.2.1. part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2010 negative photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111053</td>
			<td>step 2.1.7. for microfluidic channel patterning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y010200</td>
			<td>step 2.1.12. for photoresist developing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td>step 8.2.1. part of electroporation buffer composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>step 6.2.1&#160; 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309628</td>
			<td>step 8.3.4. part of system priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ61 Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>subsection 7.3. for channel and electrode alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Treated T25 Flasks</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353108</td>
			<td>step 8.1.2 for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium targets</td>
			<td>Kurt J. Lesker</td>
			<td></td>
			<td>subsection 4.2. for physical vapor deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency masks</td>
			<td>CAD/ART Services</td>
			<td></td>
			<td>steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>step 6.1.2. for wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fabrication and operation of a continuous flow, micro-electroporation system with permeabilization detection

Nuværende terapeutiske innovationer, såsom CAR-T-celleterapi, er stærkt afhængige af viral-medieret genlevering. Selvom den er effektiv, ledsages denne teknik af høje produktionsomkostninger, hvilket har skabt interesse for at bruge alternative metoder til genlevering. Elektroporation er en elektrofysisk, ikke-viral tilgang til intracellulær levering af gener og andre eksogene materialer. Ved påføring af et elektrisk felt tillader cellemembranen midlertidigt molekylær levering ind i cellen. Typisk udføres elektroporation på makroskalaen for at behandle et stort antal celler. Denne tilgang kræver imidlertid omfattende empirisk protokoludvikling, hvilket er dyrt, når man arbejder med primære og vanskelige at transficere celletyper. Langvarig protokoludvikling kombineret med kravet om store spændinger for at opnå tilstrækkelige elektriske feltstyrker til at gennemtrænge cellerne har ført til udviklingen af elektroporationsanordninger i mikroskala. Disse mikroelektroporationsanordninger fremstilles ved hjælp af almindelige mikrofabrikationsteknikker og giver mulighed for større eksperimentel kontrol med potentiale til at opretholde høje gennemstrømningsfunktioner. Dette arbejde bygger på en mikrofluidisk elektroporationsteknologi, der er i stand til at detektere niveauet af cellemembranpermeabilisering på et enkeltcelleniveau under kontinuerlig strømning. Denne teknologi var imidlertid begrænset til 4 celler behandlet i sekundet, og derfor foreslås og præsenteres en ny tilgang til at øge systemets gennemstrømning her. Denne nye teknik, betegnet som cellepopulationsbaseret feedbackkontrol, overvejer cellepermeabiliseringsresponsen på en række elektroporationspulserende forhold og bestemmer de bedst egnede elektroporationspulsbetingelser for celletypen under test. Der anvendes derefter en højere gennemstrømningstilstand, hvor denne 'optimale' puls påføres cellesuspensionen under transit. Trinene til fremstilling af enheden, opsætning og kørsel af mikrofluidiske eksperimenter og analyse af resultaterne præsenteres detaljeret. Endelig demonstreres denne mikroelektroporationsteknologi ved at levere et DNA-plasmid, der koder for grønt fluorescerende protein (GFP) i HEK293-celler.

Figur 4 fremhæver driftsprincipperne bag membranpermeabiliseringsdetektering på enkeltcelleniveau for en enkelt pulsamplitude. Efter initieringen af elektroporationseksperimentet bestemmer celledetekteringsalgoritmen en optimal tærskel for celledetektion via en punkt-for-punkt, hældningsbaseret detektionsmetode. Systemet overvåger derefter kontinuerligt (1) for en signifikant negativ ændring i den målte elektriske strøm, hvilket er tegn på indgangen til en celle. Dette skyldes den b...

Watch this Scientific Journal Video about The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection at JoVE.com

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Denne protokol beskriver de mikrofabrikationsteknikker, der kræves for at opbygge en lab-on-a-chip, mikrofluidisk elektroporationsenhed. Den eksperimentelle opsætning udfører kontrollerede transfektioner på enkeltcelleniveau i et kontinuerligt flow og kan udvides til højere gennemløb med populationsbaseret kontrol. Der leveres en analyse, der viser evnen til elektrisk at overvåge graden af cellemembranpermeabilisering i realtid.

Fremstilling og drift af et kontinuerligt flow, mikroelektroporationssystem med permeabiliseringsdetektion

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Denne metode giver forskere mulighed for at bestemme optimale elektroporationspulserende betingelser for den ønskede celletype, samtidig med at behovet for den traditionelle empiriske eksperimentelle tilgang minimeres. Denne metode anvender mikroelektroporationsteknikker til fremstilling af en skalerbar mikrofluidisk aktiveringsanordning, der er i stand til elektrisk overvågning af graden af cellemembranpermeabilisering gennem hele elektroporationsprocessen. Kishankumar Busha, en kandidatstuderende fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren.Til at begynde med skal du fastgøre siliciumskiven til chucken på waferspincoateren ved hjælp af spincoaterens vakuumsystem. Programmer derefter spinneren. Dernæst dispenser fire milliliter SU-8 2010 fotomodstand på midten af siliciumskiven og kør programmet.Når systemet går i stå, skal du slukke for vakuumet. Fastgør derefter fotomasken med 2D-mikrofluidkanaldesignene på maskeholderen, og indsæt siliciumskiven med SU-8-belægningen opad på waferpatronen. Indstil eksponeringsindstillingerne for 150 millijoule pr. Kvadratcentimeter, og kør maskinen.Efter UV-eksponeringen nedsænkes siliciumskiven i SU-8-udviklerløsningen med blid omrøring i tre til fire minutter. Fjern derefter waferen fra opløsningen og skyl overfladen med isopropanol. Placer derefter siliciumskiven i en 150 grader Celsius ovn i 30 minutter til en hård bagning.Lad det derefter køle ned til stuetemperatur, før du bruger stylusprofilometri til at måle den nøjagtige højde og hældning af kanalsidevæggene. Dernæst dispenser en milliliter fotomodstand på overfladen af glasrutsjebanen og kør programmet igen. Når systemet går i stå, skal du slukke for vakuumet og fjerne glasbeholderen.Når du har fastgjort fotomasken med 2D-elektrodedesignene på maskeholderen, skal du indsætte og justere glasskiven med S-1818-belægningen, der vender opad på waferpatronen. Indstil eksponeringsindstillingerne for 215 millijoule pr. Kvadratcentimeter, og kør maskinen. Efter eksponeringen nedsænkes glasrutsjebanen i MF-319 udvikleropløsning i to minutter under påføring af blid omrøring.Fjern derefter glasskiven og skyl overfladen med deioniseret vand. Til sidst skal du placere glasrutsjebanen i 150 graders Celsius-ovnen til en hård bagning, hvilket sikrer, at substratoverfladen af interesse vender opad. Efter 30 minutter skal du fjerne glideren fra ovnen og beskytte den mod lys.For at ætse glasset nedsænkes det i en 10 til 1 bufret flussyreopløsning i et minut i en polytetrafluorethylenbeholder. Overfør derefter og vask glasrutsjebanerne i deioniseret vand tre gange. Dernæst ved hjælp af et fysisk dampaflejringssystem sputter titanium i otte minutter med en hastighed på 100 angstroms i minuttet og platin i 10 minutter ved 200 angstroms per minut.Derefter for at løfte fotomodstanden nedsænkes de metalbelagte glasglider i et acetonebad i 10 minutter og sonikerer badet for at introducere agitation. Brug om nødvendigt en acetone gennemblødt klud for at fjerne eventuelle rester. Næste for polydimethylsiloxan replika støbning gør PDMS elastomer base med en hærder ved et 10 til 1 vægtforhold i en engangsbeholder placeret oven på en elektronisk balance.Hæld derefter PDMS-opløsningen over siliciumskiven og læg blandingen under et vakuum for at fjerne luftbobler. Efter hærdning af blandingen ved 65 grader Celsius i mindst fire timer, skal du bruge spidsen af et barberblad til at skære det støbte PDMS ud og skrælle det fra siliciumskiven. Fjern derefter PDMS fra enhedens indløb og udløb ved hjælp af et skærpet biopsislag.Derefter programmeres plasmageneratoren til PDMS-binding. Placer derefter PDMS og elektrodeglasglidning i systemet med funktionerne opad, og kør programmet. Når programmet er færdigt, skal du fjerne enhederne og bruge et stereoskop til hurtigt at justere kanalfunktionerne til elektroderne.Påfør tryk fra midten af PDMS mod siderne for at fjerne uønskede luftbobler ved limningsgrænsefladen. Høst HEK293-cellerne, centrifuger dem, og suspender pelleten i elektroporationsbuffer ved cirka fem millioner celler pr. Milliliter. Derefter tilsættes plasma-DNA, der koder for GFP, til en endelig koncentration på 20 mikrogram pr. milliliter og blandes forsigtigt.Overfør derefter plasma-DNA-cellesuspensionen til en sprøjte på en kubikcentimeter til eksperimentering. Placer mikroenheden på mikroskopets trin via en glideholder. Tænd derefter den opladede koblede enhed, CCD-kameraet, og bring den mikrofluidiske kanal i fokus.Næste for enkeltcelleelektroporation skal du indstille sprøjtepumpens strømningshastighed til 0,1 til 0,3 mikroliter i minuttet for at sikre strømmen af enkeltceller gennem elektrodesættet. Indstil derefter pulsparametrene for den indledende og laveste elektriske energielektroporationspuls. Følg et forudbestemt antal celleregistreringer pr. pulsapplikation.Ved afslutningen af hver testet tilstand skal du aspirere celler fra mikroenhedens udløb og genopfylde stikkontakten med genoprettelsesmedier. Gentag til den næste elektroporationspulstilstand og gentag, indtil alle elektroporationspulsforhold er testet. Bestem derefter elektroporationspulsparametrene for befolkningsbaseret feedback med høj kapacitet.For befolkningsbaseret feedback-kontrolleret elektroporation skal du indstille sprøjtepumpens strømningshastighed til en til tre mikroliter i minuttet og indstille pulsamplituden til den optimerede tilstand. Sluk derefter udløsertilstanden, og indstil pulsbredden, så den passer til celletransittiden. Når det ønskede antal celler er blevet elektroporeret, skal du slukke for både sprøjtepumpen og funktionsgeneratoren.Overfør derefter cellerne fra udløbsreservoiret til en passende størrelse cellekulturkolbe eller plade fyldt med forvarmede genvindingsmedier, og overfør kulturkolben eller pladen til en inkubator. Til dataanalyse skal du indlæse dataene i en analysesoftware og generere et plot af strøm versus tid for hver pulserende tilstand. Bestem derefter graden af cellemembranpermeabilisering, generer cellemembranpermeabiliseringskortet over alle testede pulsforhold, og kontroller den optimale pulserende tilstand.Efter inkubationen skal du tage epi-fluorescensbilleder ved hjælp af FITC og langt røde filtre og analysere billedsættene manuelt eller via en algoritme. Driftsprincipper bag permeabiliseringsdetektering på enkeltcelleniveau for en enkelt pulsamplitude fremhæves her. Efter hver elektroporationspulsparameter testes den næsthøjeste energielektroporationspuls.Cellemembranpermeabiliseringskortet for HEK293-celler viste en tydelig sammenhæng mellem påført elektrisk energi og graden af cellemembranpermeabilisering. I dette eksperiment blev en elektrisk feltstyrke på 1,8 kilovolt pr. Centimeter og en 670 mikrosekundpuls bestemt som optimal. Ved disse værdier blev der opnået en 70% elektrotransfektionseffektivitet.I modsætning til en elektrisk feltstyrke på 0,4 kilovolt pr. centimeter og en pulsvarighed på tre millisekunder var elektrotransfektionseffektiviteten ved 24 timer mindre end 5% Udtrykket opskrift, som ofte bruges, når man beskriver det specifikke i mikrofremstillingsprocessen, indsætter vigtigheden af at følge eller optimere hvert trin for at kunne fremstille en fungerende enhed. Denne elektroporationsteknologi kan bruges i yderligere biomedicinske forskningsprojekter såsom generering og test af CAR T-celler eller optimering og test af CRISPR-Cas9 genredigeringsteknikker. Denne mikroelektroporationsteknologi gør det muligt at foretage elektrisk forhør af forskellige celletypers reaktioner for at anvende de elektriske pulserende forhold og korrelere disse oplysninger til levering af klinisk relevant molekylær last.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallel-plade Flow Afdeling og Continuous Flow Circuit at evaluere endoteliale stamceller under Laminar Flow forskydningsspænding

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriel Detection og identifikation Brug elektrokemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Drift af Benchtops bioreaktor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fremstilling af polymere og biohybridfibre med foruddefineret størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Den neddykkede Trykning af celler på en modificeret overflade ved hjælp af en kontinuerlig strøm Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Følsomme Påvisning af Proteopathic Seeding Aktivitet med FRET flowcytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Hurtig Enzymatisk behandling af proteiner til MS Detection med en Flow-through Mikroreaktor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tør Film Photoresist-baserede elektrokemisk mikrofluid Biosensor Platform: Enhed fabrikation, On-chip Assay forberedelse og drift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...