Name: isolation of epithelial cells from human dental follicle
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Questo studio è stato supportato da sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (NRF-2017R1C1B2008406 e NRF-2021R1F1A1064350). Il Dr. Hee-Yeon Bae ha gentilmente fornito il DF per la cultura primaria.

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Kyung Hee University Hospital di Gangdong (approvazione IRB n. KHNMC 2017-06-009).
1. Raccogli DF
NOTA: I pazienti hanno dato il consenso informato prima dell'intervento chirurgico per la rimozione di un terzo molare colpito maturo o immaturo. Sono stati esclusi i pazienti con la seguente malattia: diabete, ipertensione, tubercolosi, epatite, sindrome da immunodeficienza acquisita. A...

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	<li>Tucker, A., Sharpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cutting-edge+of+mammalian+development;+How+the+embryo+makes+teeth.">The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).</li><li>Choung, H. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+cell-cell+Interactions+for+organoid+construction+-+are+biomaterials+dispensable.">Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Hertwig's+epithelial+root+sheath+cells+necessary+for+periodontal+formation+by+dental+follicle+cells.">Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells.</a> Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).</li><li>Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+enamel+matrix+derivative+on+healing+of+root+surfaces+after+bonding+treatment+and+intentional+replantation+of+vertically+fractured+roots.">Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots.</a> Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).</li><li>Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crowning+achievement:+getting+to+the+root+of+the+problem.">The crowning achievement: getting to the root of the problem.</a> Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).</li><li>Bonczek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+agenesis:+What+do+we+know+and+is+there+a+connection+to+cancer.">Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer.</a> Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).</li></ol>

Questo protocollo include passaggi critici. La raccolta di popolazioni monocellulari è essenziale per il successo dell'isolamento delle cellule epiteliali dalla DF. Abbiamo cercato di isolare le cellule epiteliali dal DF sulla base della nostra ipotesi che ci siano più cellule epiteliali nel DF. La procedura di tritatura migliora il distacco e il rilascio delle cellule dal DF. La procedura di tritatura è stata migliorata e la tritatura è stata ripetuta fino a quando il DF è apparso polposo per facilitare il rilascio...

La formazione dei denti inizia con l'invaginazione dell'epitelio orale1. Secondo lo stadio di sviluppo del dente, l'epitelio orale ha nomi diversi, tra cui l'epitelio dello smalto interno ed esterno, l'ansa cervicale e la guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERS). I compartimenti epiteliali comunicano con le cellule mesenchimali circostanti. Le interazioni epitelio-mesenchimali regolano la formazione dei denti e la rigenerazione dei tessuti. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali, come i cheratinociti orali e le cellule della guaina epiteliale della radice di Hertwig (HERSC), è fondamentale per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale2.
Le cellule epiteliali dentali derivate dai roditori sono isolate dalla struttura epiteliale, come l'HERS. Li e colleghi hanno isolato e immortalato le HERSC di derivazione molare del ratto dopo aver raccolto la porzione apicale dei germi dei denti in via di sviluppo da ratti di 8 giorni3. L'HERS è stato separato dal tessuto apicale sotto ingrandimento. Considerando lo stadio di sviluppo dei denti e l'età, la raccolta dell'HERS dagli esseri umani è quasi impossibile a causa di problemi etici: un germe dentale in via di sviluppo deve essere rimosso da un bambino piccolo per raccogliere l'HERS umano. I germi dei denti immaturi vengono estratti raramente. Le cellule epiteliali dentali umane possono essere isolate dalla gengiva e dal legamento parodontale (PDL). Le cellule derivate dalla struttura epiteliale partecipano alla formazione dei denti insieme ai componenti mesenchimali e potrebbero essere più adatte per lo studio delle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali rispetto ai cheratinociti orali. I resti di cellule epiteliali di Malassez (ERM) sono resti epiteliali derivati da HERS e risiedono in piccoli numeri nel PDL4. Gli studi riportano l'isolamento delle HERSC umane dalla PDL5. Tuttavia, la raccolta di HERSC umane dal tessuto PDL non ha sempre successo a causa della scarsità della popolazione epiteliale in questa posizione5,6.
Sebbene le HERSC derivate dai roditori siano mantenute in mezzi contenenti siero3,7, le cellule epiteliali umane derivate da DF sono coltivate con mezzi privi di siero simili ad altre cellule epiteliali umane, come i normali cheratinociti epidermici umani e i normali cheratinociti orali umani8,9. Ciò implica differenze fisiologiche o funzionali tra le cellule epiteliali dentali dei roditori e le cellule epiteliali dentali umane. Comprendere il meccanismo relativo alle interazioni epiteliale-mesenchimale dentale potrebbe contribuire allo sviluppo di applicazioni cliniche, tra cui il riattaccamento parodontale durante il reimpianto, la rigenerazione parodontale nella malattia parodontale, la rigenerazione del complesso polpa-dentina e la generazione di biodenti. Considerando le caratteristiche della ricerca traslazionale, le cellule epiteliali dentali umane possono essere più appropriate delle cellule epiteliali dentali dei roditori per lo studio delle interazioni epitelio-mesenchimali.
Il DF umano è un tessuto connettivo sciolto e spesso risiede in un dente colpito. Il DF contiene precursori mesenchimali10. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha riportato l'isolamento delle cellule epiteliali dai follicoli dentali prima del 2021. Oh e Yi hanno riferito l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano nel 20218. Il fenotipo epiteliale è stato confermato dal western blotting e dall'analisi morfologica. L'analisi dell'origine delle cellule epiteliali derivate da DF ha dimostrato risultati simili con altri studi. Le cellule epiteliali derivate da DF non erano né endoteliali né ematopoietiche5,11, e Oh e Yi suggerivano di nominare queste cellule come DF-HERSC. Il DF ha un volume maggiore rispetto al PDL e più cellule epiteliali possono essere isolate dal DF. Ciò migliora l'emergere di colonie epiteliali e si traduce in un alto tasso di successo nella raccolta di cellule epiteliali da DF. Questo studio suggerisce di utilizzare il DF come fonte di tessuto per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali.
Nel presente studio, singole cellule sono state isolate dal DF secondo le procedure precedentemente descritte10,12. Il DF contiene popolazioni cellulari eterogenee e diversi tipi di cellule potrebbero essere presenti nella fase iniziale della procedura. Morsczek e colleghi hanno isolato cellule staminali mesenchimali derivate da DF10. Abbiamo ipotizzato che il DF contenga cellule epiteliali e che solo le cellule epiteliali possano sopravvivere in condizioni prive di siero. Questo studio differisce da quello di Morsczek et al. in termini di selezione della popolazione epiteliale e di inibizione delle cellule mesenchimali. La selezione è stata eseguita utilizzando mezzi privi di siero di cheratinociti (SFM), che consentono la proliferazione delle cellule epiteliali e inibiscono la proliferazione delle cellule mesenchimali. Questo studio ha avuto origine da un rapporto di Oh e Yi8. Lo scopo di questo studio era quello di descrivere i dettagli del metodo utilizzato in quel rapporto per l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol</td>
			<td>EMD millipore Co., MA, USA</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon, NC, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>172958</td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>150326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>17100017</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge</td>
			<td>Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea</td>
			<td>CB-514R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea</td>
			<td>50015 
			50050</td>
			<td>15 mL 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning Inc., NY, US</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Missouri, US</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>17105041</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea</td>
			<td>&#160;LB 001-02</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>16000044</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus BB 15 / CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte serum-free medium</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>10724-011</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVE CryoSystem 2000</td>
			<td>MVE Biological Solutions Co., GA, USA</td>
			<td>CryoSystem 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>for 1.2-2 mL CryoVials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope</td>
			<td>Olympus Life Science, 
			Waltham, Massachusetts</td>
			<td>22-00723-01</td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Strep</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL (10,000 U/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid XP</td>
			<td>Drummond scientific Co., PA, USA</td>
			<td>HDR-4-000-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Classic P1000</td>
			<td>Gilson, Villiers le Bel, France</td>
			<td>F123602</td>
			<td>100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerant</td>
			<td>Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>CLN 540U</td>
			<td>~-80 &#176;C / Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet</td>
			<td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea</td>
			<td>91010</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>12605010</td>
			<td>cell dissociation protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of epithelial cells from human dental follicle

Il follicolo dentale (DF) è stato raccolto durante la rimozione di un terzo molare colpito da un chirurgo maxillo-facciale orale. L'isolamento delle cellule epiteliali è stato eseguito il giorno della raccolta DF. Il DF è stato lavato tre volte con DPBS e poi sezionato con forbici di tessuto fino a quando il tessuto ha avuto una consistenza polposa o schiacciata. Le popolazioni unicellulari sono state pellettizzate mediante centrifugazione e lavate con un mezzo privo di siero di cheratinociti. Popolazioni cellulari eterogenee sono state distribuite in un piatto di coltura. Il mezzo privo di siero dei cheratinociti è stato utilizzato per selezionare le cellule epiteliali. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni giorno fino a quando non sono stati osservati detriti galleggianti o cellule morte. Le cellule epiteliali sono apparse entro 7-10 giorni dalla distribuzione della popolazione cellulare. Le cellule epiteliali sono sopravvissute in mezzo privo di siero, mentre il mezzo essenziale minimo di modificazione α integrato con il 10% di siero bovino fetale ha permesso la proliferazione di cellule di tipo mesenchimale. Il DF è una fonte di tessuto per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali.
Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un metodo per l'isolamento delle cellule epiteliali dal DF umano. Il legamento parodontale (PDL) è stato utilizzato per l'isolamento delle cellule epiteliali dentali umane. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dalla PDL umana non ha sempre successo a causa del piccolo volume tissutale, che porta a un basso numero di cellule epiteliali. DF ha un volume maggiore di PDL e contiene più celle. DF può essere una fonte di tessuto per la coltura primaria di cellule epiteliali dentali umane. Questo protocollo è più semplice ed efficiente rispetto al metodo di isolamento che utilizza PDL. L'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali umane può facilitare ulteriori studi sulle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali.

Raccolta DF La chirurgia è stata eseguita da un chirurgo maxillo-facciale orale. I materiali di derivazione umana, tra cui il frammento del dente, il tessuto gengivale e il DF, sono stati raccolti da un chirurgo (Figura 1A). Il DF potrebbe essere attaccato al frammento del dente. Un chirurgo maxillo-facciale orale sarà in grado di identificare il DF. La cooperazione e la comunicazione con il chirurgo sono necessarie per la raccolta dei tessuti. Il DF è un tessuto simil...

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Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle (Video) | JoVE

Il follicolo dentale contiene una popolazione epiteliale e cellule mesenchimali. La popolazione epiteliale è stata selezionata dalla popolazione eterogenea di cellule follicolari dentali fornendo un terreno di coltura distinto. Le cellule epiteliali sopravvissero e formarono colonie in un mezzo privo di siero.

Isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Questo protocollo dimostra un metodo avanzato per l'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali umane. È difficile identificare il pellet di cella aggregato durante le procedure. Fai attenzione quando maneggi il surnatante per prevenire la perdita di popolazioni cellulari.Per iniziare, raccogliere i follicoli dentali durante l'estrazione chirurgica dei terzi molari colpiti. Avviare le procedure di isolamento cellulare o conservare i follicoli dentali a quattro gradi Celsius in DPBS con il 3% di penicillina-streptomicina. Per lavare i follicoli dentali, tenere il follicolo dentale con una pinzetta e metterlo nel tubo di lavaggio 1.Agitare delicatamente da 10 a 15 volte. Estrailo e mettilo nel tubo 2. Ancora una volta, agitalo da 10 a 15 volte.Infine, estrarlo e metterlo nel tubo 3, quindi agitarlo. Dopo il lavaggio tre volte, posizionare il follicolo dentale in un piatto di coltura da 60 millimetri. Tritare il tessuto con le forbici del tessuto fino a quando il follicolo dentale ha un aspetto polposo o schiacciato.Utilizzare una piccola sezione laterale del piatto di coltura per ridurre al minimo la perdita di tessuto. Mescolare un millilitro ciascuno di collagenasi di tipo 1 e soluzione di proteasi in un tubo conico da 15 millilitri. Trasferire il tessuto tritato nel tubo conico da 15 millilitri, quindi agitarlo delicatamente e incubarlo per un'ora a 37 gradi Celsius.Aggiungere cinque millilitri di 0,05% tripsina-EDTA al tubo. Agitare e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Preparare un mezzo per cheratinociti contenente un mezzo privo di siero per i cheratinociti e siero bovino fetale al 10%.Aggiungere tre millilitri di cheratinociti in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Posizionare un filtro da 40 micrometri sopra questo tubo. Quindi, aspirare il surnatante dal tubo contenente il tessuto con una pipetta sierologica da 10 millilitri e passarlo attraverso il filtro.Trasferire la sospensione raccolta in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo e rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere tre millilitri di mezzo privo di siero per cheratinociti.Centrifugare per altri tre minuti e rimuovere il surnatante. Placcare la popolazione di singole cellule in un piatto di coltura da 60 millimetri usando il mezzo privo di siero di cheratinociti. Mantenere il piatto di coltura con un volume finale di cinque millilitri in un'atmosfera umidificata del 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.Le cellule con morfologia epiteliale sono apparse entro sette-10 giorni dopo la placcatura di popolazioni monocellulari. Il numero di cellule epiteliali a forma di ciottolo variava da una a 10 al momento dell'emergenza e le cellule si espansero in colonie nel tempo. Il passo più cruciale è tritare il follicolo dentale in piccole particelle.Migliora la separazione delle singole cellule dal tessuto follicolare. Le cellule mesenchimali possono essere isolate dal follicolo dentale umano. L'ambiente di coltura contenente siero seleziona le cellule mesenchimali e inibisce la crescita epiteliale da popolazioni di singole cellule.Questo protocollo fornisce il metodo per procurare le cellule epiteliali dentali umane. Le cellule epiteliali derivate dal follicolo dentale possono essere utilizzate per lo studio delle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali.

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Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor (Video) | JoVE

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...