Name: isolation of epithelial cells from human dental follicle
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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이 연구는 한국 정부(NRF-2017R1C1B2008406 및 NRF-2021R1F1A1064350)가 지원하는 한국국립연구재단(NRF)의 보조금으로 지원되었다. 배희연 박사는 1차 문화를 위해 DF를 친절하게 제공했습니다.

이 연구는 강동경희대학병원 기관검토위원회의 승인을 받았다(IRB 승인 안부) KHNMC 2017-06-009).
1. DF 수집
참고 : 환자는 성숙하거나 미숙한 영향 세 번째 어어의 제거에 대한 수술 전에 통보 된 동의를했다. 당뇨병, 고혈압, 결핵, 간염, 면역결핍 증후군 등 다음과 같은 질환을 가진 환자는 제외되었다. 임산부도 제외되었다.
<ol><li>영향 받은 세 ?...

<ol>
	<li>Tucker, A., Sharpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cutting-edge+of+mammalian+development;+How+the+embryo+makes+teeth.">The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).</li><li>Choung, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+follicle+cells+and+cementoblasts+induce+apoptosis+of+ameloblast-lineage+and+Hertwig's+epithelial+root+sheath/epithelial+rests+of+Malassez+cells+through+the+Fas-Fas+ligand+pathway.">Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig's epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway.</a> European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).</li><li>Wan, A. C. 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이 프로토콜에는 중요한 단계가 포함됩니다. 단일 세포 집단을 수확하는 것은 DF에서 상피 세포의 성공적인 격리를 위해 필수적입니다. 우리는 DF에 더 많은 상피 세포가 있다는 우리의 가설에 근거하여 DF에서 상피 세포를 격리하기 위하여 노력했습니다. 다진 절차는 DF에서 세포의 분리 및 방출을 향상시킵니다. 미칭 절차가 개선되었고, DF가 단일 세포의 방출을 용이하게 하기 위해 펄프가 나타났...

치아 형성은 경구 상피1의 질로 시작됩니다. 치아 발달 단계에 따르면, 경구 상피는 내부 및 외부 에나멜 상피, 자궁 경부 루프 및 Hertwig의 상피 뿌리 칼집 (HERS)을 포함하여 다른 이름을 가지고 있습니다. 상피 구획은 주변 중간 엽 세포와 통신합니다. 상피 -중간 엽 상호 작용은 치아 형성과 조직 재생을 조절합니다. 구강 각질 세포와 Hertwig의 상피 뿌리 칼집 세포 (HERSC)와 같은 치과 상피 세포를 조달하는 것은 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용2의 연구에 매우 중요합니다.
설치류 유래 치과 상피 세포는 HERS와 같은 상피 구조로부터 분리된다. 리와 동료들은 8일 된 쥐3에서 발달된 치아 세균의 액면 부분을 수확한 후 고립되고 불멸의 쥐 어금니 유래 HERSC를 분리하고 불멸의 HERSC를 수집했다. HERS는 배율 하에서 정연조직으로부터 분리되었다. 치아 발달 단계와 나이를 고려할 때, 인간으로부터 HERS를 수확하는 것은 윤리적 인 문제로 인해 거의 불가능합니다 : 발달치아 세균은 인간 HERS를 수확하기 위해 어린 아이에게서 제거해야합니다. 미숙한 치아 세균은 거의 추출되지 않습니다. 인간의 치과 상피 세포는 치지바 및 치주 인대 (PDL)로부터 분리 될 수있다. 상피 구조 유래 세포는 중간엽 성분과 함께 치아 형성에 참여하고 구강 각질 세포보다 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용연구에 더 적합 할 수 있습니다. 말라세즈(ERM)의 상피 세포 받침대는 HERS 유래 상피 잔재이며 PDL4에 있는 작은 숫자에 상주한다. 연구 결과는 PDL5에서 인간 HERSCs의 격리를 보고합니다. 그러나, PDL 조직에서 인간 HERSC를 수확하는 것은 이 위치에 있는 상피 인구의 부족 때문에 항상 성공적이지 않습니다5,6.
설치류 유래 HERSC는 혈청 함유 media3,7에서 유지되지만, 인간 DF 유래 상피 세포는 정상적인 인간 표피 각질 세포 및 정상 인간 구강 각질 세포8,9과 같은 다른 인간 상피 세포와 유사한 혈청 없는 배지로 배양된다. 이것은 설치류 치과 상피 세포와 인간 치과 상피 세포 사이의 생리학적 또는 기능적 차이를 의미합니다. 치과 상피-중간엽 상호 작용에 관한 메커니즘을 이해하면 재농중치재부착, 치주질환의 치주재생, 펄프 덴틴 복합재생 및 바이오 치아 생성을 포함한 임상 응용 분야의 개발에 기여할 수 있다. 번역 연구의 특성을 고려, 인간의 치과 상피 세포는 상피 - 중간 엽 상호 작용의 연구를위한 설치류 치과 상피 세포보다 더 적합 할 수있다.
인간 DF는 느슨한 결합 조직이며 종종 영향을받은 치아에 상주합니다. DF에는 중간엽 전구체10이 포함되어 있습니다. 그러나, 우리의 지식에, 어떤 연구 도 전에 치과 여포에서 상피 세포의 격리를 보고 했다 2021. 아와 이총재는 20218년 인간 DF로부터 상피세포의 고립을 보고했다. 상피 표현형은 서양 블로팅 및 형태 분석에 의해 확인되었다. DF 유래 상피 세포의 기원에 대한 분석은 다른 연구와 유사한 결과를 입증했다. DF 유래 상피 세포는 내피나 조혈5,11도 아니었으며, 오씨와 이종은 이러한 세포를 DF-HERSC로 명명할 것을 제안했다. DF는 PDL보다 더 큰 부피를 가지며, 더 많은 상피 세포는 DF로부터 분리될 수 있다. 이것은 상피 식민지의 출현을 강화하고 DF에서 상피 세포를 수확에 높은 성공률을 초래한다. 이 연구는 치과 상피 세포의 격리를 위한 조직 근원으로 DF를 사용하여 건의합니다.
본 연구에서, 단일 세포는 이전에 설명된 절차에 따라 DF로부터 분리되었다10,12. DF는 이질적인 세포 집단을 포함하고, 몇몇 세포 모형은 절차의 초기 단계에서 존재할 수 있었습니다. Morsczek 및 동료는 DF 유래 중간엽 줄기 세포를 격리10. 우리는 DF가 상피 세포를 포함하고 만 상피 세포가 혈청없는 조건하에서 살아남을 수 있다고 가설. 이 연구는 상피 집단의 선택과 중간 엽 세포의 억제의 관점에서 Morsczek 외. 것과 다릅니다. 선택은 상피 세포 증식을 허용하고 중간 엽 세포 증식을 억제하는 각질 세포 혈청 없는 매체 (SFM)를 사용하여 수행되었다. 이 연구는 오씨와 Yi8의 보고서에서 유래했다. 이 연구의 목적은 인간 DF에서 상피 세포의 격리를 위해 그 보고에서 사용된 방법의 세부 사항을 기술하는 것이었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol</td>
			<td>EMD millipore Co., MA, USA</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon, NC, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>172958</td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>150326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>17100017</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge</td>
			<td>Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea</td>
			<td>CB-514R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea</td>
			<td>50015 
			50050</td>
			<td>15 mL 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning Inc., NY, US</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Missouri, US</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>17105041</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea</td>
			<td>&#160;LB 001-02</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>16000044</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus BB 15 / CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte serum-free medium</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>10724-011</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVE CryoSystem 2000</td>
			<td>MVE Biological Solutions Co., GA, USA</td>
			<td>CryoSystem 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>for 1.2-2 mL CryoVials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope</td>
			<td>Olympus Life Science, 
			Waltham, Massachusetts</td>
			<td>22-00723-01</td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Strep</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL (10,000 U/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid XP</td>
			<td>Drummond scientific Co., PA, USA</td>
			<td>HDR-4-000-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Classic P1000</td>
			<td>Gilson, Villiers le Bel, France</td>
			<td>F123602</td>
			<td>100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerant</td>
			<td>Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>CLN 540U</td>
			<td>~-80 &#176;C / Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet</td>
			<td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea</td>
			<td>91010</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>12605010</td>
			<td>cell dissociation protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of epithelial cells from human dental follicle

치과 여포 (DF)는 구강 상악안면 외과 의사에 의해 영향 받은 세 번째 어어를 제거하는 동안 수확되었습니다. 상피 세포 격리는 DF 수확 당일에 수행되었다. DF는 DPBS로 세 번 세척한 다음 조직이 펄프 또는 스퀴시 일관성을 가질 할 때까지 조직 가위로 해부되었습니다. 단세포 인구는 원심분리에 의해 펠렛되었고 각질 세포 혈청이 없는 매체로 세척되었다. 이질적인 세포 인구는 배양 접시에 분포되었다. 각질 세포 혈청 프리 배지는 상피 세포를 선택하는 데 사용되었습니다. 배양 배지는 부동 파편이나 죽은 세포가 관찰되지 않을 때까지 매일 변경되었다. 상피 세포는 세포 인구 분포 후에 7-10 일 안에 나타났습니다. 상피 세포는 혈청이 없는 매체에서 살아남았고, 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 α 수정 최소한의 필수 매체는 중간엽 형 세포의 증식을 허용했습니다. DF는 치과 상피 세포의 격리를 위한 조직 원입니다.
이 연구의 목적은 인간 DF로부터 상피 세포의 분리를위한 방법을 확립하는 것이었습니다. 치주 인대 (PDL)는 인간의 치과 상피 세포의 격리를 위해 사용되었다. 인간 PDL에서 상피 세포를 조달하는 것은 상피 세포의 낮은 수로 이끌어 내는 작은 조직 양 때문에 항상 성공적이지 않습니다. DF는 PDL보다 더 큰 부피를 가지며 더 많은 셀을 포함합니다. DF는 인간 치과 상피 세포의 1 차적인 문화에 대한 조직 원이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 PDL을 사용하는 격리 방법보다 쉽고 효율적입니다. 인간의 치과 상피 세포를 조달하는 것은 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용의 추가 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

DF 수확 수술은 구강 상악안면 외과 의사에 의해 수행되었다. 치아 단편, 치지발 조직 및 DF를 포함한 인간 유래 물질은 외과 의사에 의해 수집되었다(도 1A). DF는 치아 조각에 부착될 수 있습니다. 구강 상악안면 외과 의사는 DF를 식별 할 수 있습니다. 조직 수집을 위해서는 외과 의사와의 협력과 의사소통이 필요합니다. DF는 불규칙하게 모양의 막 과 같은 조직?...

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Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle (Video) | JoVE

치과 여포에는 상피 인구와 중간 엽 세포가 포함되어 있습니다. 상피 인구는 뚜렷한 배양 배지를 제공함으로써 이질적인 치과 여포 세포 집단으로부터 선택되었다. 상피 세포는 혈청이없는 배지에서 생존하고 식민지를 형성했다.

인간 치과 여포에서 상피 세포의 격리

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

이 프로토콜은 인간의 치과 상피 세포를 조달하기위한 향상된 방법을 보여줍니다. 절차 중에 집계 된 세포 펠릿을 식별하기가 어렵습니다. 손실 세포 인구를 방지하기 위해 상체를 다룰 때주의하십시오.시작하려면, 영향 받은 세 번째 어금니의 수술 추출 도중 치과 여포를 수확하십시오. 세포 격리 절차를 시작하거나 3%페니실린 연쇄 절제술로 DPBS에서 섭씨 4도에 치과 여포를 저장하십시오. 치과 여포를 씻으려면 치과 여포를 핀셋으로 잡고 세척 튜브 1에 놓습니다.부드럽게 10~ 15회 흔들어줍니다. 그것을 꺼내 튜브 2에 배치하십시오. 다시, 그것을 흔들어 10 받는 것 15 시간.마지막으로, 그것을 꺼내 튜브 3에 배치 한 다음 흔들어. 세 번 세척 한 후, 60 밀리미터 문화 접시에 치과 여포를 놓습니다. 치과 여포가 펄피 또는 squishy 외관이 될 때까지 조직 가위로 조직을 다진다.조직 손실을 최소화하기 위해 배양 접시의 작은 측면 섹션을 사용합니다. 콜라게나아제 타입 1과 프로테아제 용액 을 각각 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 섞는다. 다진 조직을 15 밀리리터 원뿔관으로 옮은 다음 부드럽게 흔들어 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.튜브에 0.05%의 트립신-EDTA의 5밀리리터를 추가합니다. 흔들어 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하세요. 각질 세포 혈청 프리 배지 및 10% 태아 소 혈청을 함유한 각질 세포 매질을 준비합니다.새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에 3밀리리터의 각질 세포 매질을 추가합니다. 이 튜브 위에 40 마이크로미터 스트레이너를 놓습니다. 다음으로, 10 밀리리터 세로지컬 파이펫으로 조직을 포함하는 튜브에서 상체를 흡인하고 여과기를 통과합니다.수집된 서스펜션을 15밀리리터 원내 튜브로 옮는다. 튜브원심분리기를 제거하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 케나티노사이클 세럼 프리 배지 의 3 밀리리터를 추가합니다.원심 분리기는 3분 간 추가로 상신포를 제거합니다. 각질 세포 세럼이 없는 배지를 사용하여 단일 세포 인구를 60mm 배양 접시에 접시를 넣습니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 가습한 분위기에서 5밀리리터의 최종 부피로 문화 접시를 유지하십시오.상피 형태를 가진 세포는 단하나 세포 인구를 도금 한 후에 7 10 일 안에 나타났습니다. 조약돌 모양의 상피 세포의 수는 출현 시에 1에서 10까지 구역 수색하고 세포는 시간이 지남에 따라 식민지로 확장되었습니다. 가장 중요한 단계는 치과 여포를 작은 입자로 다진 것입니다.그것은 여포 조직에서 단일 세포의 분리를 향상. 중간 엽 세포는 인간의 치과 여포에서 분리 될 수 있습니다. 배양 환경을 포함하는 혈청은 중간엽 세포를 선택하고 단일 세포 집단에서 상피 성장을 억제합니다.이 프로토콜은 인간의 치과 상피 세포를 조달하는 방법을 제공합니다. 치과 여포 유래 상피 세포는 치과 상피 - 중간 엽 상호 작용의 연구에 활용 될 수있다.

Research

JoVE Journal

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연구

생물학

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Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÂ¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures (Video) | JoVE

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation (Video) | JoVE

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates (Video) | JoVE

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor (Video) | JoVE

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...