Name: isolation of epithelial cells from human dental follicle
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Este estudo foi apoiado por subsídios da National Research Foundation of Korea (NRF) financiados pelo governo coreano (NRF-2017R1C1B2008406 e NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae gentilmente forneceu o DF para a cultura primária.

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Universitário Kyung Hee em Gangdong (aprovação do IRB nº. KHNMC 2017-06-009).
1. Recolher DF
NOTA: Os pacientes deram consentimento informado antes da cirurgia para a remoção de um terceiro molar maduro ou imaturo impactado. Foram excluídos pacientes com a seguinte doença: diabetes, hipertensão, tuberculose, hepatite, síndrome da imunodeficiência adquirida. As gest...

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+cell-cell+Interactions+for+organoid+construction+-+are+biomaterials+dispensable.">Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction - are biomaterials dispensable.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Hertwig's+epithelial+root+sheath+cells+necessary+for+periodontal+formation+by+dental+follicle+cells.">Are Hertwig's epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells.</a> Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).</li><li>Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+enamel+matrix+derivative+on+healing+of+root+surfaces+after+bonding+treatment+and+intentional+replantation+of+vertically+fractured+roots.">Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots.</a> Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).</li><li>Fong, H. 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Este protocolo inclui etapas críticas. A colheita de populações unicelulares é essencial para o isolamento bem sucedido das células epiteliais do DF. Procuramos isolar células epiteliais do DF com base em nossa hipótese de que há mais células epiteliais no DF. O procedimento de picar aumenta o desprendimento e a liberação de células do DF. O procedimento de picar foi melhorado, e o picar se repetiu até que o DF apareceu polpa para facilitar a liberação de células únicas. A obtenção do número máximo d...

A formação dentária começa com a invaginação do epitélio oral1. De acordo com o estágio de desenvolvimento dentário, o epitélio oral tem nomes diferentes, incluindo epitélio de esmalte interno e externo, laço cervical e bainha de raiz epitelial de Hertwig (HERS). Os compartimentos epiteliais se comunicam com as células mesenquimais circundantes. Interações epiteliais-mesenquimais regulam a formação dentária e a regeneração tecidual. A aquisição de células epiteliais dentárias, como os queratinócitos orais e as células da baia de raiz epitelial de Hertwig (HERSCs), é crucial para o estudo das interações epiteliais-mesenquimais dentárias2.
As células epiteliais dentárias derivadas de roedores são isoladas da estrutura epitelial, como o HERS. Li e colegas isolaram e imortalizaram HERSCs derivados do molar de rato após a colheita da porção apical dos germes dentários em desenvolvimento de ratos de 8 dias de idade3. O HERS foi separado do tecido apical sob ampliação. Considerando o estágio e a idade do desenvolvimento dentário, a colheita do HERS de humanos é quase impossível por causa de questões éticas: um germe dentário em desenvolvimento precisa ser removido de uma criança para colher o HERS humano. Germes dentários imaturos raramente são extraídos. As células epiteliais dentárias humanas podem ser isoladas do ligamento gengiva e periodontal (PDL). As células derivadas da estrutura epitelial participam da formação dentária juntamente com componentes mesenquimais e podem ser mais adequadas para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais dentárias do que queratinócitos orais. As células epiteliais de Malassez (ERM) são remanescentes epiteliais derivados do HERS e residem em pequenos números no PDL4. Estudos relatam o isolamento de HERSCs humanos do PDL5. No entanto, a colheita de HERSCs humanos a partir de tecido PDL nem sempre é bem sucedida devido à escassez da população epitelial neste local5,6.
Embora os HERSCs derivados de roedores sejam mantidos em mídias contendo soro3,7, as células epiteliais derivadas do DF são cultivadas com mídia livre de soro semelhante a outras células epiteliais humanas, como queratinócitos epidérmicos normais e queratinócitos orais humanos normais8,9. Isso implica diferenças fisiológicas ou funcionais entre células epiteliais dentárias de roedores e células epiteliais dentárias humanas. A compreensão do mecanismo relativo às interações epiteliais-mesenquimais dentárias pode contribuir para o desenvolvimento de aplicações clínicas, incluindo recolocação periodontal durante replantação, regeneração periodontal em doença periodontal, regeneração complexa de celulose e geração biodestina. Considerando as características da pesquisa translacional, as células epiteliais dentárias humanas podem ser mais apropriadas do que as células epiteliais de roedores para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais.
O DF humano é um tecido conjuntivo solto e muitas vezes reside em um dente impactado. O DF contém precursores mesenquimais10. No entanto, até onde sabemos, nenhum estudo relatou o isolamento de células epiteliais de folículos dentários antes de 2021. Oh e Yi relataram o isolamento das células epiteliais do DF humano em 20218. O fenótipo epitelial foi confirmado por manchas ocidentais e análise morfológica. A análise da origem das células epiteliais derivadas do DF demonstrou resultados semelhantes com outros estudos. As células epiteliais derivadas do DF não eram nem endoteliais nem hematopoiéticas5,11, e Oh e Yi sugeriram nomear essas células como DF-HERSCs. O DF tem um volume maior que o PDL, e mais células epiteliais podem ser isoladas do DF. Isso aumenta o surgimento de colônias epiteliais e resulta em uma alta taxa de sucesso na colheita de células epiteliais do DF. Este estudo sugere o uso do DF como fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.
No presente estudo, as células únicas foram isoladas do DF de acordo com os procedimentos descritos anteriormente10,12. O DF contém populações de células heterogêneas, e vários tipos de células podem estar presentes na fase inicial do procedimento. Morsczek e colegas isolaram células-tronco mesenquimais derivadas do DF10. Nós imaginamos que o DF contém células epiteliais e que apenas células epiteliais podem sobreviver sob condições livres de soro. Este estudo difere do de Morsczek et al. em termos da seleção da população epitelial e da inibição das células mesenquimais. A seleção foi realizada utilizando-se uma mídia sem soro de queratinócito (SFM), que permite a proliferação de células epiteliais e inibe a proliferação de células mesenquimais. Este estudo teve origem em um relatório de Oh e Yi8. O objetivo deste estudo foi descrever detalhes do método utilizado nesse relatório para o isolamento de células epiteliais do DF humano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol</td>
			<td>EMD millipore Co., MA, USA</td>
			<td>1096341011</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon, NC, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>172958</td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>150326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>17100017</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge</td>
			<td>Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea</td>
			<td>CB-514R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube</td>
			<td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea</td>
			<td>50015 
			50050</td>
			<td>15 mL 
			50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning Inc., NY, US</td>
			<td>430488</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Missouri, US</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>17105041</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea</td>
			<td>&#160;LB 001-02</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>16000044</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus BB 15 / CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>51023121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte serum-free medium</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>10724-011</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVE CryoSystem 2000</td>
			<td>MVE Biological Solutions Co., GA, USA</td>
			<td>CryoSystem 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>for 1.2-2 mL CryoVials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope</td>
			<td>Olympus Life Science, 
			Waltham, Massachusetts</td>
			<td>22-00723-01</td>
			<td>Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Strep</td>
			<td>Gibco, Grand island, NY, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 mL (10,000 U/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid XP</td>
			<td>Drummond scientific Co., PA, USA</td>
			<td>HDR-4-000-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Classic P1000</td>
			<td>Gilson, Villiers le Bel, France</td>
			<td>F123602</td>
			<td>100-1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerant</td>
			<td>Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>CLN 540U</td>
			<td>~-80 &#176;C / Discontinued</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet</td>
			<td>SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea</td>
			<td>91010</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA</td>
			<td>12605010</td>
			<td>cell dissociation protease</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of epithelial cells from human dental follicle

O folículo dentário (DF) foi colhido durante a remoção de um terceiro molar impactado por um cirurgião maxilofacial oral. O isolamento das células epiteliais foi realizado no dia da colheita do DF. O DF foi lavado três vezes com DPBS e depois dissecado com tesoura de tecido até que o tecido tivesse uma consistência polpa ou macia. Populações unicelulares foram pelotadas por centrifugação e lavadas com meio sem soro de queratinócito. Populações de células heterogêneas foram distribuídas em um prato de cultura. O meio sem soro de queratinócito foi usado para selecionar as células epiteliais. O meio cultural foi alterado diariamente até que não foram observados detritos flutuantes ou células mortas. As células epiteliais apareceram entre 7 e 10 dias após a distribuição da população celular. As células epiteliais sobreviveram em meio livre de soro, enquanto α meio essencial mínimo complementado com soro bovino fetal de 10% permitiu a proliferação de células do tipo mesenquimal. O DF é uma fonte tecidual para o isolamento de células epiteliais dentárias.
O objetivo deste estudo foi estabelecer um método para o isolamento das células epiteliais do DF humano. O ligamento periodontal (PDL) foi utilizado para o isolamento de células epiteliais dentárias humanas. A aquisição de células epiteliais de PDL humano nem sempre é bem sucedida devido ao pequeno volume tecidual, levando a um baixo número de células epiteliais. O DF tem um volume maior que o PDL e contém mais células. O DF pode ser uma fonte tecidual para a cultura primária das células epiteliais dentárias humanas. Este protocolo é mais fácil e eficiente do que o método de isolamento usando PDL. A aquisição de células epiteliais dentárias humanas pode facilitar estudos adicionais de interações epiteliais-mesenquimais dentárias.

Colheita do DF A cirurgia foi realizada por um cirurgião maxilofacial oral. Materiais derivados do homem, incluindo o fragmento dentário, tecido gengival e DF, foram coletados por um cirurgião (Figura 1A). O DF pode estar preso ao fragmento de dente. Um cirurgião maxilofacial oral será capaz de identificar o DF. A cooperação e a comunicação com o cirurgião são necessárias para a coleta de tecidos. O DF é um tecido de membrana em forma irregular. O tecido geng...

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Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

O folículo dentário contém uma população epitelial e células mesenquimais. A população epitelial foi selecionada da população heterogênea de folículos dentário, proporcionando um meio de cultura distinto. As células epiteliais sobreviveram e formaram colônias em um meio livre de soro.

Isolamento de Células Epiteliais do Folículo Dental Humano

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...

Este protocolo demonstra um método aprimorado para a aquisição de células epiteliais dentárias humanas. É difícil identificar a pelota celular agregada durante os procedimentos. Tenha cuidado ao lidar com supernascer para evitar a perda de populações celulares.Para começar, colhe folículos dentários durante a extração cirúrgica de terceiros molares impactados. Inicie procedimentos de isolamento celular ou armazene os folículos dentários a quatro graus Celsius em DPBS com 3% de penicilina-estreptomicina. Para lavar os folículos dentários, segure o folículo dentário com pinça e coloque-o no tubo de lavagem 1.Agite suavemente 10 a 15 vezes. Tire-o e coloque-o no tubo 2. Mais uma vez, agite de 10 a 15 vezes.Finalmente, retire-o e coloque-o no tubo 3, em seguida, agite-o. Depois de lavar três vezes, coloque o folículo dental em um prato de cultura de 60 milímetros. Pique o tecido com tesoura de tecido até que o folículo dentário tenha uma aparência polpa ou macia.Use uma pequena seção lateral do prato de cultura para minimizar a perda de tecido. Misture um mililitro cada uma da solução de colagenase tipo 1 e protease em um tubo cônico de 15 mililitros. Transfira o tecido picado para o tubo cônico de 15 mililitros, em seguida, agite-o suavemente e incuba-o por uma hora a 37 graus Celsius.Adicione cinco mililitros de 0,05% trypsin-EDTA ao tubo. Agite-o e incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius. Prepare o meio queratincyte contendo meio bovino sem soro de queratincyte e soro bovino 10%.Adicione três mililitros de meio queratincyte em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Coloque um coador de 40 micrômetros em cima deste tubo. Em seguida, aspire o supernaente do tubo contendo o tecido com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e passe-o através do coador.Transfira a suspensão coletada para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo e remover o supernaspeso. Em seguida, adicione três mililitros de meio sem soro de queratinócito.Centrifugar por mais três minutos e remover o supernatante. Coloque a população de células únicas em um prato de cultura de 60 milímetros usando o meio sem soro de queratinócito. Mantenha o prato de cultura com um volume final de cinco mililitros em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.Células com morfologia epitelial apareceram dentro de sete a dez dias após o revestimento de populações de células únicas. O número de células epiteliais em forma de paralelepípedo variou de um a 10 no momento do surgimento e as células se expandiram para colônias ao longo do tempo. O passo mais crucial é picar o folículo dentário em pequenas partículas.Aumenta a separação de células únicas do tecido folículo. Células mesenquimais podem ser isoladas do folículo dental humano. O soro que contém ambiente cultural seleciona células mesenquimais e inibe o crescimento epitelial de populações de células únicas.Este protocolo fornece o método de aquisição das células epiteliais dentárias humanas. As células epiteliais derivadas do folículo dental podem ser utilizadas para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais dentárias.

Research

JoVE Journal

Biology

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Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Biologia

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Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

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The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

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Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

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