Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (OD/NICHD DP2HD083961 و NHBLI R01HL148104). ليو كيو وان هو باحث في بيو في العلوم الطبية الحيوية (PEW 00026185) ، بدعم من صناديق بيو الخيرية. يتم دعم Haokang Zhang من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه التابعة لجمعية القلب الأمريكية (20PRE35210243).

1. تصنيع طوابع بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS)16
<ol><li>ارسم مجموعة من الحلقات الدقيقة باستخدام برنامج CAD ، بقطر داخلي يبلغ 250 ميكرومتر وقطر خارجي يبلغ 450 ميكرومتر. النمط المستخدم في هذا البروتوكول هو صفيف 10 × 10 مع مسافة 850 ميكرومتر بين الحلقات.</li>
	<li>اطبع قناع شفافية للنمط بالدقة الم...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

يوفر اختبار النقش على شكل حلقة الموصوف هنا أداة سهلة الاستخدام للتوصيف الكمي للجيرالية متعددة الخلايا ، قادرة على إنتاج نتائج موثوقة للغاية وقابلة للتكرار. يتيح التوليد السريع للبيئات الدقيقة المحددة المتطابقة والتحليل غير المتحيز المعالجة الآلية عالية الإنتاجية لحجم كبير من العينات. ?...

يصف عدم تناسق الخلية من اليسار إلى اليمين (LR) ، المعروف أيضا باسم اليد الخلوية أو chirality ، قطبية الخلية في محور LR ومن المعترف به أنه خاصية فيزيائية حيوية أساسية ومحفوظة1،2،3،4،5. وقد لوحظت الخلية في كل من الجسم الحي والمختبر على مستويات متعددة. وكشفت النتائج السابقة عن دوران الهيكل الخلوي للأكتين في خلايا مفردة مزروعة في جزر دائرية6 ، وهجرة متحيزة ومحاذاة الخلايا داخل الحدود المحصورة7،8،9،10،11 ، وحلقة غير متماثلة لأنبوب حرارة الدجاج 12.
على المستوى متعدد الخلايا ، يمكن تحديد الخلية من الهجرة الاتجاهية أو المحاذاة ، والدوران الخلوي ، وديناميكيات الهيكل الخلوي ، وتحديد مواقع عضيات الخلية7،8،9،10،11،12،13. لقد أنشأنا14 فحصا قائما على الأنماط الدقيقة لتوصيف التحيز الدائري للخلايا الملتصقة بكفاءة7،8،9،10. مع الأنماط الدقيقة على شكل حلقة تحصر هندسيا مجموعات الخلايا ، تظهر الخلايا بشكل جماعي هجرة اتجاهية ومحاذاة متحيزة. تم تطوير برنامج MATLAB للكشف تلقائيا عن محاذاة الخلايا وقياسها في صور تباين الطور للحلقة. يتم تحديد اتجاه محاذاة الخلايا المحلية بزاوية متحيزة ، اعتمادا على انحرافها عن الاتجاه المحيطي. بعد التحليل الإحصائي ، يتم تعيين نمط الحلقة للخلايا إما على أنه تحيزات عكس اتجاه عقارب الساعة (CCW) أو تحيزات في اتجاه عقارب الساعة (CW).
وقد استخدم هذا الفحص لتوصيف الأنماط الظاهرية للخلايا المتعددة (الجدول 1)، ووجد أن عدم تناسق الخلايا LR خاص بالنمط الظاهري 7,11,15. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تعطيل ديناميكيات الأكتين والمورفولوجيا إلى عكس التحيز الدائري 7,8 ، ويمكن أن يؤدي الإجهاد التأكسدي إلى تغيير الخلية وكذلك9. بسبب بساطة الإجراء ومتانة النهج7،8،9،10 ، يوفر هذا الفحص 2D chirality أداة فعالة وموثوقة لتحديد ودراسة chirality متعددة الخلايا في المختبر.
الغرض من هذا البروتوكول هو إثبات استخدام هذه الطريقة لتوصيف الخلية chirality. يصف هذا البروتوكول كيفية تصنيع صفائف خلوية منقوشة عبر تقنية الطباعة المتناغمة الدقيقة وإجراء تحليل الدائري بطريقة آلية باستخدام برنامج MATLAB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

Chirality هي خاصية خلوية جوهرية ، والتي تصور عدم التماثل من حيث الاستقطاب على طول المحور الأيسر الأيمن للخلية. نظرا لأن هذه الخاصية الفريدة تجذب اهتماما متزايدا بسبب أدوارها المهمة في كل من التطور والمرض ، فإن طريقة القياس الكمي الموحدة لتوصيف الخلية من شأنها أن تعزز الأبحاث والتطبيقات المحتملة. في هذا البروتوكول ، نصف اختبار توصيف chirality متعدد الخلايا الذي يستخدم صفائف الخلايا المجهرية النمطية. يتم تصنيع الأنماط الدقيقة الخلوية على شرائح زجاجية مطلية بالتيتانيوم / الذهب عبر الطباعة المتناغمة الدقيقة. بعد البذر على الجزر المحددة هندسيا (على سبيل المثال ، على شكل حلقة) ، المغلفة بالبروتين ، تهاجر الخلايا في الاتجاه وتشكل محاذاة متحيزة نحو اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة ، والتي يمكن تحليلها تلقائيا وتحديدها كميا بواسطة برنامج MATLAB مكتوب خصيصا. هنا نصف بالتفصيل تصنيع الركائز المجهرية ، وبذر الخلايا ، وجمع الصور ، وتحليل البيانات وإظهار النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام خلايا NIH / 3T3. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول سابقا في العديد من الدراسات المنشورة وهو أداة فعالة وموثوقة لدراسة الخلية في المختبر.

بعد خمس عشرة دقيقة من بذر خلايا NIH / 3T3 ، تم تأكيد التصاق الخلايا على نمط الحلقة بصريا عن طريق التصوير بتباين الطور. بعد زراعة لاحقة لمدة 24 ساعة ، أصبحت الخلايا الموجودة على الأنماط ملتقية وممدودة مع محاذاة غير متماثلة بشكل واضح ، متحيزة نحو اتجاه عقارب الساعة (الشكل 2). يتم تس?...

Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

نقدم بروتوكولا لتحديد التناهية متعددة الخلايا في المختبر ، باستخدام تقنية التنميط الدقيق. يسمح هذا الفحص بالقياس الكمي التلقائي للتحيزات بين اليسار واليمين لأنواع مختلفة من الخلايا ويمكن استخدامه لأغراض الفحص.

فحص التنميط الدقيق لقياس الخلية

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

يعد اختبار التشنج المجهري للخلايا الباست أداة قوية لدراسة التشكل الدائري متعدد الخلايا في تطور المرض. ومن المهم أيضا لبحوث الخلايا. نظام النمط الكلي هذا سهل التصنيع والاستخدام ، وهو قادر على إنتاج نتائج موثوقة للغاية وقابلة للتكرار ، كما أنه متوافق مع المعالجة التلقائية عالية الإنتاجية لحجم العينة الكبير.ابدأ بقطع الشريحة المطلية بالذهب من التيتانيوم إلى قطع مربعة صغيرة تبلغ مساحتها حوالي 12 × 12 ملم. باستخدام قاطع زجاجي ، انزلق عبر السطح لترك مسار مسنن ، ثم أمسك الشريحة الزجاجية على كلا الجانبين وانحني عند الانحناء لاقتحام أرباع صغيرة. لتنظيف الشريحة ، انقعها مع الجانب الذهبي في الإيثانول بنسبة 100٪ الموجود في طبق بتري على شاكر مداري لمدة 10 دقائق على الأقل.بعد شفط الإيثانول ، جفف الشريحة عن طريق النفخ بتيار النيتروجين. نظف طوابع polydimethylsiloxane أو PDMS بالماء والصابون قبل تجفيف الختم بغاز النيتروجين. قم بإذابة 5.74 ملليغرام من أوكتاديكانيثيول أو C18 في 10 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 100٪ لصنع محلول C18 ملليمولين ، ثم قم بتنظيف طوابع PDMS باستخدام 100٪ إيثانول.انقع ختم PDMS مع سطح النمط المواجه لأسفل في محلول C18 لمدة 10 ثوان ثم جففه بلطف بغاز النيتروجين لمدة 60 ثانية. بمجرد تجفيفه ، ضع الختم متجها لأسفل على الشريحة الذهبية لمدة 60 ثانية قبل الإزالة. لضمان الختم السليم ، انقر برفق على الملقط على الختم لنقل الأنماط بشكل صحيح.بعد ذلك ، قم بإعداد غرف الرطوبة عن طريق سحب ملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول في غطاء طبق بتري مقلوب. وباستخدام الملقط ، ضع قطعة من البارافيلم لتغطية السطح لضمان عدم بقاء فقاعات. إزالة الإيثانول الزائد إذا لزم الأمر.أضف 40 قطرة ميكرولتر من محلول EG3 لكل شريحة زجاجية ربع سنوية على البارافيلم في غرفة الرطوبة ، مع ترك مساحة كافية بين القطرات لحساب تباعد الشرائح الذهبية. استخدم الملقط لوضع شريحة الذهب المطبوعة C18 متجهة لأسفل على القطرة، مما يضمن عدم بقاء أي فقاعات تحت الشريحة. ادفع الشرائح معا برفق دون رفعها لتقليل التبخر.بعد إغلاق طبق بتري بإحكام باستخدام البارافيلم ، اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل. في خزانة السلامة الأحيائية ، انقع وشطف شريحة الذهب التي تواجه ثلاث مرات في 70٪ من الإيثانول لإزالة EG3 ، ثم اتركها في الإيثانول لمدة 10 دقائق للتعقيم. بعد شفط الإيثانول ، أضف PBS معقمة.قم بإعداد غرفة رطوبة أخرى باستخدام PBS بدلا من الإيثانول كما هو موضح. بعد ذلك ، أضف 50 قطرة ميكرولتر من محلول الفيبرونيكتين لكل ربع شريحة على البارافيلم ، تاركا بعض المساحة بين القطرات. ثم ضع الشريحة متجهة لأسفل على القطيرة كما هو موضح سابقا واترك طبق بتري في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة.بعد شطف الشريحة المطلية بالذهب ثلاث مرات، ضع الشريحة متجهة لأعلى في PBS. قبل بذر الخلايا ، قم بتسخين الوسائط والتريبسين في حمام مائي خفف من درجة حرارة 37 درجة مئوية. للحصول على ملحق خلية أفضل، انقع شريحة النمط في صفيحة من 12 بئرا تحتوي على وسائط استزراع وقم بتسخينها عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.بمجرد أن يتم تربسين الخلايا ، قم بتحييد الخلايا باستخدام FBS التي تحتوي على وسائط ، وقم بتكسير الخلايا بسرعة 100 مرة G لمدة ثلاث دقائق ثم أعد تعليق حبيبات الخلايا في وسائط جديدة. عد الخلايا وقم بتخفيف تعليق الخلية لتحقيق تركيز 200،000 خلية لكل ملليلتر. أضف 0.5 ملليلتر من تعليق الخلايا إلى كل بئر يحتوي على شريحة ذهبية واحدة.رج الطبق بلطف عدة مرات لبذر الخلايا بشكل موحد قبل احتضانها لمدة 15 دقيقة لتركيب الخلية. بعد 15 دقيقة ، تحقق من مرفق الخلية تحت المجهر ، وإذا لزم الأمر ، احتضن لبعض الوقت. بمجرد ربط الخلايا ، قم بسحب الوسائط التي تحتوي على خلايا غير متصلة من كل بئر وأضف ملليلتر واحد من وسائط الثقافة الطازجة.قم بزراعة الخلايا في الحاضنة لمدة 24 ساعة وتحقق من الالتقاء لتحديد ما إذا كانت chirality قد تشكلت. عندما يتم تحقيق الالتقاء المطلوب ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إزالة وسائط الثقافة. بعد الشطف باستخدام PBS مرة واحدة ، أضف محلول بارافورمالدهيد 4٪ إلى الشريحة واحتضن درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الشطف مرة أخرى باستخدام PBS ثلاث مرات.للحصول على الصور، استخدم مجهر تباين الطور مع وظائف الكاميرا والتقط كل حلقة على الشريحة بدقة عالية. لتوصيف chirality ، قم بتنزيل ملفات التعليمات البرمجية MATLAB ، وأضف مجلد التعليمات البرمجية والمجلدات الفرعية إلى مسار MATLAB وافتح ROI_selection. م ملف.في السطر الرابع، قم بتغيير الدليل إلى مجلد البيانات المطلوب. قم بتغيير حجم الصورة في السطر 14 مع أول شكلين يمثلان حجم الدائرة الداخلية للحلقة بينما يمثل الشكلان الآخران الشكل الخارجي. لتحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار في صور تباين المرحلة، قم بتنفيذ التعليمات البرمجية MATLAB ROI_selection.m بالنقر فوق الزر تشغيل. اسحب مربع التحديد يدويا لاحتواء الحلقة، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق الصورة لتأكيد التحديد. بعد تحديد عائد الاستثمار من جميع الصور الموجودة في المجلد ، سيتم إنشاء ملف حصيرة لتخزين معلومات عائد الاستثمار لكل صورة.ثم افتح analysis_batch. m ملف وتغيير دليل المجلد كما هو موضح من قبل. انقر فوق الزر "تشغيل" لتنفيذ التعليمات البرمجية analysis_batch.m لتحديد التناغم بين أنماط الحلقات الخلوية المتعددة. A datatoexcel. سيتم إنشاء ملف txt يحتوي على إحصائيات دائرية لكل حلقة ، بالإضافة إلى أرقام الحلقات غير الدائرية في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة.تظهر النتائج الحالية فائدة اختبار نمط الحلقة المطور تجريبيا بالإضافة إلى حساسية هذا الفحص للتغيرات في الهيكل الخلوي. في هذه الدراسة ، وجد أنه من خلال تعطيل بلمرة الأكتين باستخدام 50 نانومولار لاترونكولين A ، أظهرت خلايا الفأر Myoblast C2C12 تغييرا في التحيز الدائري عكس اتجاه عقارب الساعة أو CCW إلى اتجاه عقارب الساعة أو CW.In بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الخلايا البطانية الوعائية السرية البشرية أو hUVECs التي عولجت ب 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate أو TPA لتنشيط بروتين كيناز C تحولا يعتمد على الجرعة من chirality الخلايا من CW إلى CCW. بعد بذر الخلايا إلى الأنماط ، يمكن استكمال المواد الكيميائية أو الأدوية إلى الوسط لدراسة الاستجابة ، ويمكن دمج نظام transwell لدراسة الزراعة المشتركة للخلايا.يوفر هذا الفحص أداة فعالة للتحقيق في الجيرالية متعددة الخلايا في ظل إعدادات تجريبية مختلفة تقدم رؤى مهمة حول دور الخلية في مختلف الظواهر والعمليات البيولوجية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

البوليمرات الذاكرة شكل خلية للثقافة أحدث

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

عضوي النمط I الكولاجين الفحص: A منهاج طيع لتقييم سلوك الخلية في سياق الأبعاد 3-

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

نموذج ثلاثي الأبعاد للخلية ثقافة قياس آثار تدفق السائل الخلالي على غزو الخلايا السرطانية

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

حقن مكروي الجرح الفحص و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

قياس TCR-PMHC التجليد<em&gt; في الموقع</em&gt; باستخدام الميكروسكوب الفحص القائم على الحنق

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...