Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
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这项工作由美国国立卫生研究院（OD / NICHD DP2HD083961和NHBLI R01HL148104）资助。Leo Q. Wan是皮尤生物医学科学学者（PEW 00026185），由皮尤慈善信托基金支持。张浩康由美国心脏协会博士前奖学金（20PRE35210243）支持。

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）邮票的制作16
<ol><li>使用CAD软件绘制一系列微尺度环，内径为250μm，外径为450μm。该协议中使用的模式是10 x 10阵列，环之间的距离为850μm。</li>
	<li>使用微细加工公司的掩模打印服务以所需分辨率打印图案的透明掩模（请参见 材料表）。 注意：所提供的环尺寸已被证明适用于许多7型细胞。</li>
	<li>使用含有所需特征的?...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

这里描述的环形图案化测定为定量表征多细胞手性提供了一种易于使用的工具，能够产生高度可靠和可重复的结果。快速生成相同的定义微环境和无偏倚分析，可实现大尺寸样品的自动化高通量处理。该协议讨论了环微图案的制造，细胞图案化以及偏置细胞排列和定向运动的自动分析。该方法与实时成像技术兼容，用于研究细胞运动和手性形态发生，并且可以潜在地集成到其他平面形式中，用于?...

细胞的左右（LR）不对称性，也称为细胞手性或手性，描述了LR轴上的细胞极性，并且被认为是基本的，保守的生物物理性质1，2，3，4，5。在体内和体外以多种尺度观察到细胞手性。先前的研究结果揭示了接种在圆形岛屿6上的单细胞中肌动蛋白细胞骨架的手性旋转，在受限边界7，8，9，10，11内细胞的偏向迁移和排列，以及鸡热管12的不对称循环。
在多细胞水平上，细胞手性可以通过定向迁移或排列，细胞旋转，细胞骨架动力学和细胞器定位7，8，9，10，11，12，13来确定。我们已经建立了一种基于微图案化的14测定法，以有效地表征贴壁细胞7，8，9，10的手性偏倚。随着环形微图案几何地限制细胞簇，细胞集体表现出定向迁移和偏置对齐。开发了一个MATLAB程序，以自动检测和测量环的相差图像中的细胞对齐。局部像元对齐的方向用偏置角度进行量化，这取决于它与圆周方向的偏差。在统计分析之后，细胞的环模式被指定为逆时针（CCW）偏差或顺时针（CW）偏差。
该测定已被用于表征多种细胞表型的手性（表1），并且已发现细胞的LR不对称性具有表型特异性7，11，15。此外，对肌动蛋白动力学和形态的破坏可导致手性偏倚7，8的逆转，氧化应激也可以改变细胞手性9。由于程序的简单性和方法7，8，9，10的鲁棒性，该2D手性测定为在体外测定和研究多细胞手性提供了有效可靠的工具。
该协议的目的是演示使用这种方法来表征细胞手性。该协议描述了如何通过微接触打印技术制造图案化蜂窝阵列，并使用MATLAB程序以自动方式进行手性分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

手性是一种固有的细胞特性，它描绘了沿着细胞左右轴极化的不对称性。由于这种独特的性质由于其在发育和疾病中的重要作用而受到越来越多的关注，因此用于表征细胞手性的标准化定量方法将推进研究和潜在应用。在该协议中，我们描述了一种利用微图案化细胞阵列的多细胞手性表征测定。蜂窝微图案通过微接触印刷在钛/镀金的载玻片上制造。在几何定义的（例如，环形的），蛋白质包被的岛屿上接种后，细胞定向迁移并形成朝时针或逆时针方向的偏倚对齐，这可以通过定制编写的MATLAB程序自动分析和量化。在这里，我们详细描述了微图案底物的制造，细胞接种，图像收集和数据分析，并显示了使用NIH / 3T3细胞获得的代表性结果。该方案先前已在多个已发表的研究中得到验证，是 体外研究细胞手性的高效可靠工具。

在NIH / 3T3细胞接种15分钟后，通过相衬成像视觉上确认细胞在环图案上的粘附。在随后培养24小时后，图案上的细胞变得融合并细长，具有明显的不对称对齐方式，偏向顺时针方向（图2）。通过延时成像记录附着细胞的定向迁移，细胞运动和形态发生可以通过进一步分析视频来量化。为了进行手性分析，在固定后拍摄高分辨率相差图像（图2A-C</str...

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A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

我们提出了一种使用微图案化技术 在体外测定多细胞手性的方案。该测定允许自动定量各种类型细胞的左右偏倚，并可用于筛选目的。

一种用于测量细胞手性的微图案化检测

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

微图案化底细胞手性测定是研究疾病发展中多细胞手性形态发生的有力工具。它对细胞研究也很重要。该宏观模式系统易于制造和使用，能够产生高度可靠和可重复的结果，并且还与大样本量的自动化高通量处理兼容。首先将钛金涂层载玻片切割成约12×12毫米的小方块。使用玻璃切割机，在表面上滑动以留下凹痕状轨道，然后在两侧握住载玻片并在凹痕处弯曲以分成小区域。要清洁载玻片，请将其与黄金面一起浸泡在轨道振荡器上的培养皿中所含的100%乙醇中至少10分钟。吸出乙醇后，用氮气流吹干载玻片。在用氮气干燥印章之前，用肥皂水清洁聚二甲基硅氧烷或PDMS印章。将5.74毫克十八烷硫醇或C18溶于10毫升100%乙醇中，制成两毫摩尔C18溶液，然后用100%乙醇清洗PDMS印章。将图案表面朝下的PDMS印章浸泡在C18溶液中10秒钟，然后用氮气轻轻干燥60秒。干燥后，将印章面朝下放在金质载玻片上60秒钟，然后取出。为确保正确冲压，请轻轻地将镊子轻拍到印章上，以正确转移图案。接下来，通过将一毫升70%乙醇移液到倒置的培养皿盖中来制备湿度室。使用镊子，铺上一块石蜡膜覆盖表面，确保没有气泡残留。如果需要，请除去多余的乙醇。在湿度室的parafilm中，每四分之一载载玻片添加40微升EG3溶液，在液滴之间留出足够的空间来考虑金载玻片的间距。使用镊子将 C18 打印的金色载玻片面朝下放在液滴上，确保载玻片下方没有气泡。轻轻地将载玻片推在一起，不要提起它们，以尽量减少蒸发。用薄膜密封培养皿后，将其置于室温下至少三个小时。在生物安全柜中，在70%乙醇中浸泡并冲洗金载玻片正面朝上三次以除去EG3，然后在乙醇中放置10分钟进行灭菌。吸出乙醇后，加入无菌PBS。如图所示，用PBS代替乙醇制备另一个湿度室。接下来，每四分之一加入50微升的纤连蛋白溶液滴到parafil上，在液滴之间留出一些空间。然后如前所述，将载玻片面朝下放在液滴上，并将培养皿放在生物安全柜中30分钟。将镀金载玻片冲洗三次后，将载玻片正面朝上放在PBS中。在接种细胞之前，在温度为37摄氏度的水浴中加热培养基和胰蛋白酶。为了更好地附着细胞，将图案载玻片浸泡在含有培养基的12孔板中，并在培养箱中以37摄氏度加热。一旦细胞被胰蛋白酶消化，用含有FBS的培养基中和细胞，以100倍G沉淀细胞三分钟，然后将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。计数细胞并稀释细胞悬浮液以达到每毫升200， 000个细胞的浓度。向每个含有一个金载玻片的孔中加入0.5毫升细胞悬浮液。轻轻摇动平板几次以获得均匀的细胞接种，然后孵育15分钟以进行细胞附着。15分钟后，在显微镜下检查细胞附着物，如果需要，再孵育一段时间。一旦细胞附着，从每个孔中抽出含有未附着细胞的培养基，并加入一毫升新鲜培养基。在培养箱中培养细胞24小时，并检查汇合度以确定手性是否已经形成。当达到所需的汇合度时，通过去除培养基来固定细胞。用PBS冲洗一次后，向载玻片中加入4%多聚甲醛溶液，室温孵育15分钟，然后用PBS再次冲洗三次。要获取图像，请使用具有相机功能的相差显微镜，并以高分辨率捕获载玻片上的每个环。对于手性表征，请下载 MATLAB 代码文件，将代码文件夹和子文件夹添加到 MATLAB 路径，然后打开ROI_selection。m 文件。在第四行中，将目录更改为所需的数据文件夹。更改第 14 行中的图像大小，前两个数字表示戒指的内圆大小，而其他两个数字表示外圈大小。要确定相差图像中的感兴趣区域或 ROI，请执行 MATLAB 代码ROI_selection。m，单击运行按钮。手动拖动选择方块以适合戒指，然后双击图像以确认选择。从文件夹中的所有图像中选择ROI后，将生成一个mat文件来存储每个图像的ROI信息。然后打开analysis_batch。m 文件，然后更改文件夹的目录，如前所述。单击“运行”按钮以执行代码analysis_batch。m用于确定多个细胞环模式的手性。一个数据到excel。将生成txt文件，其中包含每个环的圆形统计信息，以及顺时针非手性和逆时针环的数量。目前的发现证明了开发的环模式手性测定在实验上的效用以及该测定对细胞骨架变化的敏感性。在本研究中发现，通过用50纳摩尔latrunculin A处理破坏肌动蛋白聚合，小鼠成肌细胞C2C12细胞表现出逆时针或CCW手性偏倚的改变，顺时针或 CW.In 添加，用12-o-十四烷基-佛bol-13-乙酸酯或TPA处理的人脐血管内皮细胞或hUVEC以激活蛋白激酶C表现出细胞手性从CW到CCW的剂量依赖性转移。在细胞接种到模式后，可以将化学物质或药物补充到培养基中以研究反应，并且可以结合transwell系统来研究细胞共培养。该测定为研究不同实验环境下的多细胞手性提供了一种有效的工具，为细胞手性在各种生物现象和过程中的作用提供了重要的见解。

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