Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (OD / NICHD DP2HD083961 og NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan er en Pew Scholar i Biomedicinsk Videnskab (PEW 00026185), støttet af Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang støttes af American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).

1. Fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) stempler16
<ol><li>Tegn en række mikroskalaringe ved hjælp af CAD-software med en indvendig diameter på 250 μm og en ydre diameter på 450 μm. Mønsteret, der anvendes i denne protokol, er et 10 x 10 array med en afstand på 850 μm mellem ringe.</li>
	<li>Udskriv en gennemsigtighedsmaske af mønsteret i den ønskede opløsning ved hjælp af en mikrofabrikationsvirksomheds maskeudskrivningstjeneste (se Materialetabel). BEMÆR...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

Det ringformede mønsterassay, der er beskrevet her, giver et brugervenligt værktøj til kvantitativ karakterisering af multicellulær chiralitet, der er i stand til at producere meget pålidelige og repeterbare resultater. Hurtig generering af identiske definerede mikromiljøer og upartisk analyse muliggør automatiseret behandling med høj kapacitet af store størrelser af prøver. Denne protokol diskuterer fremstillingen af ringmikromønstrene, cellemønster og automatisk analyse af den forudindtagede cellejustering ...

Venstre-højre (LR) asymmetri af cellen, også kendt som cellulær handedness eller chiralitet, beskriver cellepolariteten i LR-aksen og anerkendes som en grundlæggende, bevaret, biofysisk egenskab 1,2,3,4,5. Cellechiralitet er blevet observeret både in vivo og in vitro på flere skalaer. Tidligere resultater afslørede chiral hvirvlen af actincytoskelet i enkeltceller podet på cirkulære øer6, forudindtaget migration og justering af celler inden for begrænsede grænser 7,8,9,10,11 og asymmetrisk looping af kyllingevarmerør12.
På det multicellulære niveau kan cellechiralitet bestemmes ud fra retningsbestemt migration eller justering, cellulær rotation, cytoskeletal dynamik og celleorganelpositionering 7,8,9,10,11,12,13. Vi har etableret et mikromønsterbaseret14 assay for effektivt at karakterisere den chirale bias af klæbende celler 7,8,9,10. Med de ringformede mikromønstre, der geometrisk begrænser celleklynger, udviser cellerne kollektivt retningsbestemt migration og forudindtaget justering. Et MATLAB-program blev udviklet til automatisk at registrere og måle cellejustering i fasekontrastbilleder af ringen. Retningen af lokal cellejustering kvantificeres med en forspændt vinkel afhængigt af dens afvigelse fra omkredsretningen. Efter statistisk analyse betegnes cellernes ringmønster enten som CCW-forstyrrelser (mod uret) eller med uret (CW) forstyrrelser.
Dette assay er blevet brugt til at karakterisere chiraliteten af flere cellefænotyper (tabel 1),og LR-asymmetrien af celler har vist sig at være fænotypespecifik 7,11,15. Desuden kan forstyrrelse af aktindynamik og morfologi resultere i en reversering af chiral bias 7,8, og oxidativ stress kan også ændre cellechiralitet9. På grund af procedurens enkelhed og robustheden af tilgangen 7,8,9,10 giver dette 2D-chiralitetsassay et effektivt og pålideligt værktøj til bestemmelse og undersøgelse af multicellulær chiralitet in vitro.
Formålet med denne protokol er at demonstrere brugen af denne metode til at karakterisere cellechiralitet. Denne protokol beskriver, hvordan man fremstiller mønstrede cellulære arrays via mikrokontaktudskrivningsteknik og udfører chiralitetsanalyse på en automatiseret måde ved hjælp af MATLAB-programmet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

Chiralitet er en iboende cellulær egenskab, som skildrer asymmetrien med hensyn til polarisering langs cellens venstre-højre akse. Da denne unikke egenskab tiltrækker stigende opmærksomhed på grund af sine vigtige roller i både udvikling og sygdom, ville en standardiseret kvantificeringsmetode til karakterisering af cellechiralitet fremme forskning og potentielle anvendelser. I denne protokol beskriver vi et multicellulært chiralitetskarakteriseringsassay, der bruger mikromønstrede arrays af celler. Cellulære mikromønstre fremstilles på titanium / guldbelagte glasrutschebaner via mikrokontaktudskrivning. Efter såning på de geometrisk definerede (f.eks. Ringformede), proteinbelagte øer, migrerer celler retningsbestemt og danner en forudindtaget justering mod enten uret eller mod uret retning, som automatisk kan analyseres og kvantificeres ved hjælp af et specialskrevet MATLAB-program. Her beskriver vi detaljeret fremstillingen af mikromønstrede substrater, cellesåning, billedindsamling og dataanalyse og viser repræsentative resultater opnået ved hjælp af NIH / 3T3-cellerne. Denne protokol er tidligere blevet valideret i flere offentliggjorte undersøgelser og er et effektivt og pålideligt værktøj til at studere cellechiralitet in vitro.

Femten minutter efter såningen af NIH / 3T3-celler blev celleadhæsion på ringmønsteret visuelt bekræftet ved fasekontrastbilleddannelse. Efter efterfølgende dyrkning på 24 timer blev cellerne på mønstrene sammenflydende og aflange med klart asymmetriske justeringer, forspændt mod urets retning (figur 2). Retningsbestemt migration af vedhæftede celler registreres ved time-lapse-billeddannelse, cellemotilitet og morfogenese kan kvantificeres med yderligere analyser af videoen. For a...

Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

Vi præsenterer en protokol til bestemmelse af multicellulær chiralitet in vitro ved hjælp af mikromønsterteknikken. Dette assay giver mulighed for automatisk kvantificering af venstre-højre bias af forskellige typer celler og kan bruges til screeningsformål.

Et mikromønsteranalyse til måling af cellechiralitet

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

Mikromønsteret bastcelle chiralitet assay er et kraftfuldt værktøj til at studere multicellulær chiral morfogenese i udvikling af sygdom. Det er også vigtigt for celleforskning. Dette makromønstersystem er let at fremstille og bruge, er i stand til at producere meget pålidelige og repeterbare resultater, og det er også kompatibelt med automatiseret behandling med høj gennemstrømning til stor prøvestørrelse.Start med at skære det titanium guldbelagte dias i små firkantede stykker på ca. 12 ved 12 millimeter. Brug en glasskærer til at glide hen over overfladen for at efterlade et bulet spor, hold derefter glasglideren på begge sider og bøj ved bulen for at bryde ind i små kvartaler. For at rengøre diaset skal du lægge det i blød med guldsiden op i 100% ethanol indeholdt i en petriskål på en orbital shaker i mindst 10 minutter.Efter opsugelse af ethanolen tørres glideren ved at blæse med en nitrogenstrøm. Rengør polydimethylsiloxan- eller PDMS-stemplerne med sæbevand, inden stemplet tørres med nitrogengas. Opløs 5,74 mg octadecanethiol eller C18 i 10 ml 100% ethanol for at fremstille to millimolære C18-opløsninger, og rengør derefter PDMS-frimærkerne med 100% ethanol.Blødgør PDMS-stemplet med mønsteroverfladen nedad i C18-opløsning i 10 sekunder, og tør det derefter forsigtigt med nitrogengas i 60 sekunder. Når det er tørret, skal du lægge stemplet nedad på guldglideren i 60 sekunder, før det fjernes. For at sikre korrekt stempling skal du forsigtigt trykke pincetten på stemplet for at overføre mønstrene korrekt.Forbered derefter fugtighedskamrene ved at pipettere en milliliter 70% ethanol i et omvendt petriskålslåg. Og brug pincetten til at lægge et stykke parafilm ned for at dække overfladen for at sikre, at der ikke er bobler tilbage. Fjern overskydende ethanol, hvis det er nødvendigt.Tilsæt 40 mikroliterdråber EG3-opløsning for hvert kvart glas, der glider på parafilmen i fugtighedskammeret, hvilket giver tilstrækkelig plads mellem dråber til at tage højde for afstanden mellem guldglider. Brug pincet til at placere det C18-trykte guldskred med nedadvendte nedad på dråben, så du sikrer, at der ikke forbliver bobler under diaset. Skub forsigtigt gliderne sammen uden at løfte dem for at minimere fordampningen.Efter forsegling af petriskålen tæt med parafilm, lad den stå ved stuetemperatur i mindst tre timer. I et biosikkerhedsskab skal du suge og skylle guldglideren, der vender op tre gange i 70% ethanol for at fjerne EG3, og derefter lade den stå i ethanol i 10 minutter til sterilisering. Efter opsugelse af ethanolen tilsættes steril PBS.Forbered et andet fugtighedskammer med PBS i stedet for ethanol som påvist. Derefter tilsættes 50 mikroliterdråber fibronectinopløsning for hvert kvartal, der glider på parafilmen, hvilket efterlader noget mellemrum mellem dråber. Placer derefter glideren nedad på dråben som tidligere demonstreret, og lad petriskålen stå i biosikkerhedsskabet i 30 minutter.Når du har skyllet det guldbelagte dias tre gange, skal du placere glideren, der vender op mod PBS. Før såning af cellerne opvarmes medierne og trypsin i et vandbad hærdet ved 37 grader Celsius. For bedre cellefastgørelse skal du suge mønsterglideret i en 12-brønds plade indeholdende kulturmedier og varme det ved 37 grader Celsius i inkubatoren.Når cellerne er trypsiniseret, neutraliserer cellerne med FBS-indeholdende medier, pelleter cellerne ned ved 100 gange G i tre minutter og derefter resuspend cellepillen i friske medier. Tæl cellerne og fortynd cellesuspensionen for at opnå koncentrationen på 200.000 celler pr. Milliliter. Tilsæt 0,5 ml cellesuspension til hver brønd, der indeholder et guldglas.Ryst forsigtigt pladen et par gange for ensartet cellesåning, inden du inkuberer i 15 minutter til cellefastgørelse. Efter 15 minutter skal du kontrollere cellefastgørelsen under et mikroskop og om nødvendigt inkubere i lidt mere tid. Når cellerne er fastgjort, aspirere medierne, der indeholder ikke-fastgjorte celler fra hver brønd og tilsæt en milliliter friske kulturmedier.Kultur cellerne i inkubatoren i 24 timer og kontroller sammenløbet for at afgøre, om chiralitet er dannet. Når den krævede sammenløb er opnået, skal du rette cellerne ved at fjerne kulturmediet. Efter skylning med PBS en gang tilsættes 4% paraformaldehydopløsning til diaset og inkuberes stuetemperatur i 15 minutter, før der skylles igen med PBS tre gange.For at erhverve billederne skal du bruge et fasekontrastmikroskop med kamerafunktionalitet og fange hver ring på diaset i høj opløsning. For chiralitetskarakterisering skal du downloade MATLAB-kodefilerne, tilføje kodemappen og undermapperne til MATLAB-stien og åbne ROI_selection. m fil.I linje fire skal du ændre mappen til den ønskede datamappe. Skift billedstørrelsen i linje 14 med de to første figurer, der repræsenterer ringens indre cirkelstørrelse, mens de to andre repræsenterer den ydre. For at bestemme interesseområdet eller ROI i fasekontrastbillederne skal du udføre MATLAB-koden ROI_selection.m ved at klikke på knappen Kør. Træk markeringsfirkanten manuelt, så den passer til ringen, og dobbeltklik derefter på billedet for at bekræfte det valgte. Når du har valgt ROI fra alle billederne i mappen, genereres en måttefil til lagring af ROI-oplysningerne for hvert billede.Åbn derefter analysis_batch. m fil og ændre mappens mappe som vist før. Klik på knappen Kør for at udføre koden analysis_batch.m for at bestemme chiraliteten af flere cellulære ringmønstre. En datatoexcel. txt-fil genereres, der indeholder cirkulær statistik for hver ring samt antallet af ikke-chirale og mod uret ringe.De nuværende resultater viser nytten af det udviklede ringmønster chiralitetsassay eksperimentelt såvel som følsomheden af dette assay over for ændringer i cytoskelettet. I den foreliggende undersøgelse blev det konstateret, at ved at forstyrre actinpolymerisationen med 50 nanomolære latrunculin A-behandling udviste musemyoblast C2C12-cellerne en ændring af mod uret eller CCW chiral bias i uret eller CW.In tilføjelse viste de humane navlestrengende vaskulære endotelceller eller hUVEAN'er, der blev behandlet med 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetat eller TPA for at aktivere proteinkinase C, et dosisafhængigt skift af cellechiralitet fra CW til CCW. Efter cellesåning til mønstrene kan kemikalier eller lægemidler suppleres med mediet for at studere respons, og transwell-systemet kan inkorporeres for at studere cellekokultur.Dette assay giver et effektivt værktøj til at undersøge multicellulær chiralitet under forskellige eksperimentelle indstillinger giver vigtig indsigt i cellens chiralitets rolle i forskellige biologiske fænomener og processer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human trofoblasten celler som en model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensional Cell Culture Model for måling af virkningerne af interstitielvæske Flow på tumorcelleinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Mikroinjektion Wound Assay og<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisering af epidermale Wound Respons Journalister i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Måling TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Ved hjælp af et FRET-baseret assay Microscopy

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og Samling af 3D mikrokar

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogeler fra Pulmonal ekstracellulære matrix for 3D cellekultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...