Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 en NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan is een Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), ondersteund door de Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang wordt ondersteund door american heart association predoctoral fellowship (20PRE35210243).

1. Vervaardiging van polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels16
<ol><li>Teken een reeks microschaalringen met BEHULP VAN CAD-software, met een binnendiameter van 250 μm en een buitendiameter van 450 μm. Het patroon dat in dit protocol wordt gebruikt is een array van 10 x 10 met een afstand van 850 μm tussen ringen.</li>
	<li>Druk een transparantiemasker van het patroon af met de gewenste resolutie met behulp van de maskerafdrukservice van een microfabricagebedrijf (zie Materialentabel</st...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

De ringvormige patroontest die hier wordt beschreven, biedt een eenvoudig te gebruiken hulpmiddel voor kwantitatieve karakterisering van meercellige chiraliteit, in staat om zeer betrouwbare en herhaalbare resultaten te produceren. Snelle generatie van identieke gedefinieerde micro-omgevingen en onbevooroordeelde analyse maakt geautomatiseerde high-throughput verwerking van grote hoeveelheden monsters mogelijk. Dit protocol bespreekt de fabricage van de ringmicropatronen, celpatronen en automatische analyse van de bevoor...

Links-rechts (LR) asymmetrie van de cel, ook bekend als cellulaire handvaardigheid of chiraliteit, beschrijft de celpolariteit in de LR-as en wordt erkend als een fundamentele, geconserveerde, biofysische eigenschap 1,2,3,4,5. Celchiraliteit is zowel in vivo als in vitro op meerdere schalen waargenomen. Eerdere bevindingen onthulden chirale werveling van actinecytoskelet in enkele cellen gezaaid op cirkelvormige eilanden6, bevooroordeelde migratie en uitlijning van cellen binnen begrensde grenzen 7,8,9,10,11 en asymmetrische lusing van kippenwarmtebuis 12.
Op meercellig niveau kan celchiraliteit worden bepaald aan de hand van directionele migratie of uitlijning, cellulaire rotatie, cytoskeletale dynamica en celorganelpositionering 7,8,9,10,11,12,13. We hebben een op micropatterning gebaseerde14-assay opgesteld om de chirale bias van aanhangende cellen efficiënt te karakteriseren 7,8,9,10. Met de ringvormige micropatronen die celclusters geometrisch beperken, vertonen de cellen gezamenlijk directionele migratie en bevooroordeelde uitlijning. Er is een MATLAB-programma ontwikkeld om automatisch de celuitlijning te detecteren en te meten in fasecontrastbeelden van de ring. De richting van de lokale celuitlijning wordt gekwantificeerd met een bevooroordeelde hoek, afhankelijk van de afwijking van de omtrekrichting. Na statistische analyse wordt het ringpatroon van cellen aangeduid als contraklokkend (CCW) biases of met de klok mee (CW) biases.
Deze test is gebruikt om de chiraliteit van meerdere celfenotypen te karakteriseren (tabel 1) en de LR-asymmetrie van cellen is fenotypespecifiekgebleken 7,11,15. Bovendien kan verstoring van de actinedynamica en morfologie resulteren in een omkering van chirale bias 7,8, en oxidatieve stress kan ook de celchiraliteit veranderen9. Vanwege de eenvoud van de procedure en de robuustheid van de benadering 7,8,9,10, biedt deze 2D-chiraliteitstest een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor het bepalen en bestuderen van meercellige chiraliteit in vitro.
Het doel van dit protocol is om het gebruik van deze methode aan te tonen om celchiraliteit te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe patroon cellulaire arrays kunnen worden vervaardigd via microcontactdruktechniek en chiraliteitsanalyses op een geautomatiseerde manier kunnen worden uitgevoerd met behulp van het MATLAB-programma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

Chiraliteit is een intrinsieke cellulaire eigenschap, die de asymmetrie weergeeft in termen van polarisatie langs de links-rechts as van de cel. Omdat deze unieke eigenschap steeds meer aandacht trekt vanwege zijn belangrijke rol in zowel ontwikkeling als ziekte, zou een gestandaardiseerde kwantificeringsmethode voor het karakteriseren van celchiraliteit onderzoek en potentiële toepassingen bevorderen. In dit protocol beschrijven we een meercellige chiraliteitskarakteriseringstest die gebruik maakt van microgepatterde arrays van cellen. Cellulaire micropatronen worden vervaardigd op titanium / goud gecoate glasplaten via microcontactprinten. Na het zaaien op de geometrisch gedefinieerde (bijv. ringvormige), eiwit-gecoate eilanden, migreren cellen richtingsgewijs en vormen een bevooroordeelde uitlijning naar de klok mee of de tegen de klok in richting, die automatisch kan worden geanalyseerd en gekwantificeerd door een op maat geschreven MATLAB-programma. Hier beschrijven we in detail de fabricage van microgepatterde substraten, celzaaien, beeldverzameling en gegevensanalyse en tonen we representatieve resultaten verkregen met behulp van de NIH / 3T3-cellen. Dit protocol is eerder gevalideerd in meerdere gepubliceerde studies en is een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van celchiraliteit in vitro.

Een kwartier na het zaaien van NIH/3T3-cellen werd de celadhesie op het ringpatroon visueel bevestigd door fasecontrastbeeldvorming. Na een daaropvolgende kweek van 24 uur werden cellen op de patronen confluent en langwerpig met duidelijk asymmetrische uitlijningen, vertekend naar de richting met de klok mee (figuur 2). Directionele migratie van gehechte cellen wordt geregistreerd door time-lapse beeldvorming, celmotiliteit en morfogenese kunnen worden gekwantificeerd met verdere analyses va...

Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

We presenteren een protocol voor het bepalen van meercellige chiraliteit in vitro, met behulp van de micropatterning-techniek. Deze test maakt automatische kwantificering van de links-rechts vooroordelen van verschillende soorten cellen mogelijk en kan worden gebruikt voor screeningsdoeleinden.

Een micropatterning-test voor het meten van celchiraliteit

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

De micropatterning bastcel chiraliteitstest is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van meercellige chirale morfogenese bij de ontwikkeling van ziekten. Het is ook belangrijk voor celonderzoek. Dit macropattern-systeem is eenvoudig te fabriceren en te gebruiken, kan zeer betrouwbare en herhaalbare resultaten produceren en is ook compatibel met geautomatiseerde high-throughput verwerking voor grote steekproefgrootte.Begin met het snijden van de titanium vergulde dia in kleine vierkante stukjes van ongeveer 12 bij 12 millimeter. Schuif met behulp van een glassnijder over het oppervlak om een gedeukte baan achter te laten, houd vervolgens de glasplaat aan beide zijden vast en buig bij de deuk om in kleine kwartalen te breken. Om de dia schoon te maken, weekt u deze met de gouden kant omhoog in 100% ethanol in een petrischaaltje op een orbitale shaker gedurende ten minste 10 minuten.Na het aanzuigen van de ethanol droog je de glijbaan door te blazen met een stikstofstroom. Reinig de polydimethylsiloxaan- of PDMS-stempels met een sopje voordat u de stempel droogt met stikstofgas. Los 5,74 milligram octadecanethiol of C18 op in 10 milliliter 100% ethanol om twee millimolaire C18-oplossing te maken en reinig vervolgens de PDMS-stempels met 100% ethanol.Week de PDMS-stempel met het patroonoppervlak naar beneden gericht in C18-oplossing gedurende 10 seconden en droog het vervolgens voorzichtig af met stikstofgas gedurende 60 seconden. Eenmaal gedroogd, leg de stempel 60 seconden naar beneden op de gouden glijbaan voordat u deze verwijdert. Om een goede stempeling te garanderen, tikt u het pincet voorzichtig op de stempel om de patronen op de juiste manier over te brengen.Bereid vervolgens de vochtigheidskamers voor door een milliliter 70% ethanol in een omgekeerd petrischaaldeksel te pipetteren. En leg met het pincet een stuk parafilm neer om het oppervlak te bedekken, zodat er geen bubbels achterblijven. Verwijder indien nodig de overtollige ethanol.Voeg 40 microliter druppels EG3-oplossing toe voor elke kwart glasschuif op de parafilm in de vochtigheidskamer, zodat er voldoende ruimte tussen de druppels overblijft om rekening te houden met de afstand van de gouden dia's. Gebruik een pincet om de C18-bedrukte gouden dia naar beneden op de druppel te plaatsen, zodat er geen bubbels onder de dia blijven. Duw de glijders voorzichtig tegen elkaar zonder ze op te tillen om verdamping te minimaliseren.Nadat u de petrischaal goed hebt afgesloten met parafilm, laat u deze ten minste drie uur op kamertemperatuur staan. Laat in een bioveiligheidskast de gouden glijbaan drie keer naar boven in 70% ethanol weken en afspoelen om EG3 te verwijderen en laat vervolgens 10 minuten in ethanol staan voor sterilisatie. Voeg na het opzuigen van de ethanol steriel PBS toe.Bereid een andere vochtigheidskamer voor met PBS in plaats van ethanol zoals aangetoond. Voeg vervolgens 50 microliter druppels fibronectine-oplossing toe voor elke kwartschuif op de parafilm, waardoor er wat ruimte tussen de druppels overblijft. Plaats vervolgens de schuif naar beneden op de druppel zoals eerder gedemonstreerd en laat de petrischaal 30 minuten in de bioveiligheidskast staan.Nadat u de vergulde dia driemaal hebt gespoeld, plaatst u de dia naar boven in PBS. Voordat u de cellen zaait, verwarmt u de media en trypsine in een waterbad getemperd op 37 graden Celsius. Voor een betere celaanhechting weekt u de patroonschuif in een 12-well plaat met kweekmedia en verwarmt u deze bij 37 graden Celsius in de incubator.Zodra de cellen zijn trypsine, neutraliseert u de cellen met FBS-bevattende media, pellett u de cellen gedurende drie minuten op 100 maal G en resuspendeert u de celkorrel in verse media. Tel de cellen en verdun de celsuspensie om de concentratie van 200.000 cellen per milliliter te bereiken. Voeg 0,5 milliliter van de celsuspensie toe aan elke put met één gouden dia.Schud de plaat een paar keer voorzichtig voor uniforme celzaaiing voordat u gedurende 15 minuten broedt voor celaanhechting. Controleer na 15 minuten de celaanhechting onder een microscoop en incubeer indien nodig nog een tijdje. Zodra de cellen zijn bevestigd, zuigt u de media met niet-aangebonden cellen uit elke put en voegt u een milliliter verse kweekmedia toe.Kweek de cellen in de couveuse gedurende 24 uur en controleer de samenvloeiing om te bepalen of chiraliteit zich heeft gevormd. Wanneer de vereiste samenvloeiing is bereikt, fixeert u de cellen door de kweekmedia te verwijderen. Voeg na eenmaal spoelen met PBS 4% paraformaldehyde-oplossing toe aan de dia en incubeer 15 minuten op kamertemperatuur voordat u drie keer opnieuw spoelt met PBS.Om de beelden te verkrijgen, gebruikt u een fasecontrastmicroscoop met camerafunctionaliteit en legt u elke ring op de dia vast met een hoge resolutie. Voor chiraliteitskarakterisering downloadt u de MATLAB-codebestanden, voegt u de codemap en submappen toe aan het MATLAB-pad en opent u de ROI_selection. m bestand.Wijzig in regel vier de map in de gewenste gegevensmap. Wijzig de afbeeldingsgrootte in regel 14 waarbij de eerste twee figuren de binnenste cirkelgrootte van de ring vertegenwoordigen, terwijl de andere twee de buitenste vertegenwoordigen. Om het interessegebied of de ROI in de fasecontrastafbeeldingen te bepalen, voert u de MATLAB-code ROI_selection uit.m door op de knop Uitvoeren te klikken. Sleep het selectievierkant handmatig om in de ring te passen en dubbelklik vervolgens op de afbeelding om de selectie te bevestigen. Nadat u roi hebt geselecteerd uit alle afbeeldingen in de map, wordt een matbestand gegenereerd om de ROI-informatie voor elke afbeelding op te slaan.Open vervolgens de analysis_batch. m bestand en verander de map van de map zoals eerder gedemonstreerd. Klik op de knop Uitvoeren om de code analysis_batch uit te voeren.m om de chiraliteit van meerdere cellulaire ringpatronen te bepalen. Een datatoexcel. txt-bestand wordt gegenereerd met cirkelvormige statistieken voor elke ring, evenals de aantallen niet-chirale en tegen de klok in ringen met de klok mee.De huidige bevindingen tonen het nut van de ontwikkelde ringpatroon chiraliteitstest experimenteel aan, evenals de gevoeligheid van deze test voor veranderingen in het cytoskelet. In de huidige studie werd gevonden dat door het verstoren van de actinepolymerisatie met 50 nanomolaire latrunculine A-behandeling, de muismyoblast C2C12-cellen een verandering vertoonden van tegen de klok in of CCW chirale bias in met de klok mee of CW.In toevoeging, de menselijke navelstreng vasculaire endotheelcellen of hUVEC's die werden behandeld met 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetaat of TPA om het eiwitkinase C te activeren, vertoonden een dosisafhankelijke verschuiving van celchiraliteit van CW naar CCW. Na celzaaien naar de patronen kunnen chemicaliën of geneesmiddelen worden aangevuld met het medium om de respons te bestuderen, en het transwell-systeem kan worden opgenomen om celcocultuur te bestuderen.Deze test biedt een efficiënt hulpmiddel voor het onderzoeken van meercellige chiraliteit onder verschillende experimentele omgevingen en biedt belangrijke inzichten in de rol van celchiraliteit in verschillende biologische verschijnselen en processen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape Memory Polymeren voor actieve cel Cultuur

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning en montage van 3D microvaten

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...