Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
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Ce travail a été financé par les National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 et NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan est un boursier Pew en sciences biomédicales (PEW 00026185), soutenu par les Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang est soutenu par l’American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).

1. Fabrication de timbres en polydiméthylsiloxane (PDMS)16
<ol><li>Dessinez un réseau d’anneaux à micro-échelle à l’aide d’un logiciel de CAO, d’un diamètre intérieur de 250 μm et d’un diamètre extérieur de 450 μm. Le modèle utilisé dans ce protocole est un réseau de 10 x 10 avec une distance de 850 μm entre les anneaux.</li>
	<li>Imprimez un masque transparent du motif à la résolution souhaitée à l’aide du service d’impression de masques d’une société de mic...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

Le test de motif en forme d’anneau décrit ici fournit un outil facile à utiliser pour la caractérisation quantitative de la chiralité multicellulaire, capable de produire des résultats très fiables et reproductibles. La génération rapide de microenvironnements définis identiques et l’analyse impartiale permettent un traitement automatisé à haut débit d’échantillons de grande taille. Ce protocole traite de la fabrication des micromotifs annulaires, de la structure cellulaire et de l’analyse automatiqu...

L’asymétrie gauche-droite (LR) de la cellule, également connue sous le nom de maniabilité cellulaire ou chiralité, décrit la polarité cellulaire dans l’axe LR et est reconnue comme une propriété biophysique fondamentale et conservée 1,2,3,4,5. La chiralité cellulaire a été observée in vivo et in vitro à plusieurs échelles. Des résultats antérieurs ont révélé un tourbillon chiral du cytosquelette d’actine dans des cellules individuelles ensemencées sur des îlots circulaires6, une migration et un alignement biaisés des cellules dans des limites confinées 7,8,9,10,11 et une boucle asymétrique du tube chauffant de poulet 12.
Au niveau multicellulaire, la chiralité cellulaire peut être déterminée à partir de la migration ou de l’alignement directionnel, de la rotation cellulaire, de la dynamique du cytosquelette et du positionnement des organites cellulaires 7,8,9,10,11,12,13. Nous avons établi un test14 basé sur le micromodèlement pour caractériser efficacement le biais chiral des cellules adhérentes 7,8,9,10. Avec les micromotifs en forme d’anneau confinant géométriquement les amas de cellules, les cellules présentent collectivement une migration directionnelle et un alignement biaisé. Un programme MATLAB a été développé pour détecter et mesurer automatiquement l’alignement des cellules dans les images à contraste de phase de l’anneau. La direction de l’alignement local des cellules est quantifiée avec un angle biaisé, en fonction de son écart par rapport à la direction circonférentielle. Après analyse statistique, le motif en anneau des cellules est désigné soit comme des biais dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW), soit comme des biais dans le sens des aiguilles d’une montre (CW).
Ce test a été utilisé pour caractériser la chiralité de phénotypes cellulaires multiples (tableau 1), et l’asymétrie LR des cellules s’est avérée être spécifique au phénotype 7,11,15. De plus, la perturbation de la dynamique et de la morphologie de l’actine peut entraîner une inversion du biais chiral 7,8, et le stress oxydatif peut également altérer la chiralité cellulaire9. En raison de la simplicité de la procédure et de la robustesse de l’approche 7,8,9,10, ce test de chiralité 2D fournit un outil efficace et fiable pour déterminer et étudier la chiralité multicellulaire in vitro.
Le but de ce protocole est de démontrer l’utilisation de cette méthode pour caractériser la chiralité cellulaire. Ce protocole décrit comment fabriquer des réseaux cellulaires à motifs via la technique d’impression par microcontact et effectuer une analyse de chiralité de manière automatisée à l’aide du programme MATLAB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

La chiralité est une propriété cellulaire intrinsèque, qui dépeint l’asymétrie en termes de polarisation le long de l’axe gauche-droite de la cellule. Comme cette propriété unique attire de plus en plus l’attention en raison de ses rôles importants dans le développement et la maladie, une méthode de quantification normalisée pour caractériser la chiralité cellulaire ferait progresser la recherche et les applications potentielles. Dans ce protocole, nous décrivons un test de caractérisation de chiralité multicellulaire qui utilise des réseaux de cellules micromotifs. Les micromotifs cellulaires sont fabriqués sur des lames de verre revêtues de titane / or via l’impression par microcontact. Après avoir ensemencé sur les îlots géométriquement définis (par exemple, en forme d’anneau) enrobés de protéines, les cellules migrent directionnellement et forment un alignement biaisé dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, qui peut être automatiquement analysé et quantifié par un programme MATLAB écrit sur mesure. Nous décrivons ici en détail la fabrication de substrats à micromotifs, l’ensemencement cellulaire, la collecte d’images et l’analyse de données et montrons des résultats représentatifs obtenus à l’aide des cellules NIH / 3T3. Ce protocole a déjà été validé dans de multiples études publiées et constitue un outil efficace et fiable pour étudier la chiralité cellulaire in vitro.

Quinze minutes après l’ensemencement des cellules NIH/3T3, l’adhésion des cellules sur le motif de l’anneau a été confirmée visuellement par imagerie à contraste de phase. Après une culture ultérieure de 24 h, les cellules sur les motifs sont devenues confluentes et allongées avec des alignements clairement asymétriques, biaisés dans le sens des aiguilles d’une montre (Figure 2). La migration directionnelle des cellules attachées est enregistrée par imagerie time-lapse, ...

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A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

Nous présentons un protocole pour déterminer la chiralité multicellulaire in vitro, en utilisant la technique du micromodèlement. Ce test permet une quantification automatique des biais gauche-droite de divers types de cellules et peut être utilisé à des fins de dépistage.

Un test de micromodélisme pour mesurer la chiralité cellulaire

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

Le test de chiralité des cellules libériennes à micromotifs est un outil puissant pour étudier la morphogenèse chirale multicellulaire dans le développement de la maladie. Il est également important pour la recherche cellulaire. Ce système de macromotitre est facile à fabriquer et à utiliser, est capable de produire des résultats hautement fiables et reproductibles, et il est également compatible avec le traitement automatisé à haut débit pour les échantillons de grande taille.Commencez par couper la glissière recouverte d’or en titane en petits morceaux carrés d’environ 12 par 12 millimètres. À l’aide d’un coupe-verre, glissez sur la surface pour laisser une trace bosselée, puis maintenez la glissière de verre des deux côtés et pliez-la à la bosse pour se briser en petits quartiers. Pour nettoyer la lame, faites-la tremper avec le côté or vers le haut dans de l’éthanol 100% contenu dans une boîte de Petri sur un agitateur orbital pendant au moins 10 minutes.Après avoir aspiré l’éthanol, sécher la lame en soufflant avec un flux d’azote. Nettoyez les tampons en polydiméthylsiloxane ou PDMS avec de l’eau savonneuse avant de sécher le tampon avec de l’azote gazeux. Dissoudre 5,74 milligrammes d’octadécanéthiol ou de C18 dans 10 millilitres d’éthanol à 100% pour obtenir une solution de C18 de deux millimolaires, puis nettoyer les tampons PDMS avec de l’éthanol à 100%.Faire tremper le tampon PDMS avec la surface du motif orientée vers le bas dans une solution de C18 pendant 10 secondes, puis sécher doucement avec de l’azote gazeux pendant 60 secondes. Une fois séché, posez le tampon vers le bas sur la glissière en or pendant 60 secondes avant de le retirer. Pour assurer un estampage correct, tapotez doucement la pince à épiler sur le tampon pour transférer correctement les motifs.Ensuite, préparez les chambres d’humidité en pipetant un millilitre d’éthanol à 70% dans un couvercle de boîte de Petri inversé. Et à l’aide de la pince à épiler, déposez un morceau de parafilm pour couvrir la surface en veillant à ce qu’il ne reste pas de bulles. Retirez l’excès d’éthanol si nécessaire.Ajouter 40 gouttelettes de microlitre de solution EG3 pour chaque quart de verre coulissant sur le parafilm dans la chambre d’humidité, en laissant suffisamment d’espace entre les gouttelettes pour tenir compte de l’espacement des lames d’or. Utilisez une pince à épiler pour placer la glissière dorée imprimée C18 vers le bas sur la gouttelette, en veillant à ce qu’aucune bulle ne reste sous la glissière. Poussez doucement les glissières ensemble sans les soulever pour minimiser l’évaporation.Après avoir scellé hermétiquement la boîte de Petri avec du parafilm, laissez-la à température ambiante pendant au moins trois heures. Dans une armoire de biosécurité, tremper et rincer la lame d’or tournée vers le haut trois fois dans de l’éthanol à 70% pour éliminer l’EG3, puis laisser dans l’éthanol pendant 10 minutes pour la stérilisation. Après avoir aspiré l’éthanol, ajoutez du PBS stérile.Préparez une autre chambre d’humidité avec du PBS au lieu de l’éthanol comme démontré. Ensuite, ajoutez 50 gouttelettes de microlitre de solution de fibronectine pour chaque quart de lame sur le parafilm, en laissant un peu d’espace entre les gouttelettes. Placez ensuite la glissière vers le bas sur la gouttelette comme démontré précédemment et laissez la boîte de Petri dans l’armoire de biosécurité pendant 30 minutes.Après avoir rincé la glissière recouverte d’or trois fois, placez la glissière vers le haut dans PBS. Avant d’ensemencer les cellules, réchauffez le milieu et la trypsine dans un bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius. Pour une meilleure fixation cellulaire, trempez la lame de motif dans une plaque de 12 puits contenant des milieux de culture et réchauffez-la à 37 degrés Celsius dans l’incubateur.Une fois les cellules trypsinisées, neutralisez les cellules avec des milieux contenant du FBS, abattez les cellules à 100 fois G pendant trois minutes, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu frais. Compter les cellules et diluer la suspension cellulaire pour atteindre la concentration de 200 000 cellules par millilitre. Ajouter 0,5 millilitre de suspension cellulaire à chaque puits contenant une lame dorée.Secouez doucement la plaque plusieurs fois pour un ensemencement cellulaire uniforme avant d’incuber pendant 15 minutes pour la fixation cellulaire. Après 15 minutes, vérifiez la fixation de la cellule au microscope et, si nécessaire, incubez pendant un certain temps. Une fois les cellules attachées, aspirez les milieux contenant des cellules non attachées de chaque puits et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais.Cultivez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures et vérifiez la confluence pour déterminer si la chiralité s’est formée. Lorsque la confluence requise est atteinte, fixez les cellules en retirant le milieu de culture. Après rinçage avec du PBS une fois, ajouter une solution de paraformaldéhyde à 4% à la lame et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avant de rincer à nouveau avec du PBS trois fois.Pour acquérir les images, utilisez un microscope à contraste de phase avec fonctionnalité de caméra et capturez chaque anneau sur la diapositive en haute résolution. Pour la caractérisation de la chiralité, téléchargez les fichiers de code MATLAB, ajoutez le dossier de code et les sous-dossiers au chemin MATLAB et ouvrez le ROI_selection. m fichier.À la ligne quatre, remplacez le répertoire par le dossier de données souhaité. Modifiez la taille de l’image à la ligne 14 avec les deux premières figures représentant la taille du cercle intérieur de l’anneau tandis que les deux autres représentant l’extérieur. Pour déterminer la région d’intérêt ou le retour sur investissement dans les images à contraste de phase, exécutez le code MATLAB ROI_selection.m en cliquant sur le bouton Exécuter. Faites glisser manuellement le carré de sélection pour l’adapter à l’anneau, puis double-cliquez sur l’image pour confirmer la sélection. Après avoir sélectionné le retour sur investissement parmi toutes les images du dossier, un fichier mat sera généré pour stocker les informations de retour sur investissement de chaque image.Ouvrez ensuite le analysis_batch. m et modifiez le répertoire du dossier comme illustré précédemment. Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code analysis_batch.m pour déterminer la chiralité de plusieurs modèles d’anneaux cellulaires. Un datatoexcel. Un fichier txt contenant des statistiques circulaires pour chaque anneau, ainsi que le nombre d’anneaux non chiraux et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre sera généré.Les résultats actuels démontrent expérimentalement l’utilité du test de chiralité en anneau développé ainsi que la sensibilité de ce test aux altérations du cytosquelette. Dans la présente étude, il a été constaté qu’en perturbant la polymérisation de l’actine avec un traitement à la latrunculine A de 50 nanomolaires, les cellules C2C12 du myoblaste de souris présentaient une altération du biais chiral dans le sens inverse des aiguilles d’une montre ou dans le sens CW.In, les cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines ou les hUVEC qui ont été traitées avec de l’acétate de 12-o-tétradécanoyl-phorbol-13 ou TPA pour activer la protéine kinase C présentaient un déplacement dose-dépendant de la chiralité cellulaire de CW à CCW. Après l’ensemencement cellulaire aux motifs, des produits chimiques ou des médicaments peuvent être complétés dans le milieu pour étudier la réponse, et le système transwell peut être incorporé pour étudier la co-culture cellulaire.Ce test fournit un outil efficace pour étudier la chiralité multicellulaire dans différents contextes expérimentaux offrant des informations importantes sur le rôle de la chiralité cellulaire dans divers phénomènes et processus biologiques.

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