Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (OD /NICHD DP2HD083961 ו- NHBLI R01HL148104). ליאו ק. וואן הוא חוקר פיו במדעים ביו-רפואיים (PEW 00026185), הנתמך על ידי נאמנויות הצדקה של פיו. האוקאנג ג'אנג נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (20PRE35210243).

1. ייצור חותמות פולידימתילסילוקסן (PDMS)16
<ol><li>ציירו מערך של טבעות בקנה מידה זעיר באמצעות תוכנת CAD, עם קוטר פנימי של 250 מיקרומטר וקוטר חיצוני של 450 מיקרומטר. התבנית המשמשת בפרוטוקול זה היא מערך של 10 x 10 עם מרחק של 850 מיקרומטר בין טבעות.</li>
	<li>הדפס מסכת שקיפות של התבנית ברזולוציה הרצו?...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

בדיקת התבניות בצורת טבעת המתוארת כאן מספקת כלי קל לשימוש לאפיון כמותי של כיראליות רב-תאית, המסוגלת להפיק תוצאות אמינות ביותר וניתנות לחזרה. ייצור מהיר של מיקרו-סביבה מוגדרת זהה וניתוח בלתי מוטה מאפשר עיבוד אוטומטי בתפוקה גבוהה של דגימות בגודל גדול. פרוטוקול זה דן בייצור המיקרו-פטרנים הטב?...

אסימטריה שמאל-ימין (LR) של התא, הידועה גם בשם ידיים תאיות או כיראליות, מתארת את קוטביות התא בציר LR ומוכרת כתכונה ביופיזית בסיסית, שמורה, 1,2,3,4,5. כיראליות התא נצפתה הן in vivo והן in vitro במספר קשקשים. ממצאים קודמים חשפו מערבולת כיראלית של שלד אקטין ציטוסקלטון בתאים בודדים שנזרעו באיים עגולים6, נדידה ויישור מוטים של תאים בתוך גבולות מוגבלים 7,8,9,10,11, ולולאה א-סימטרית של צינור חום עוף 12.
ברמה הרב-תאית, כיראליות התאים יכולה להיקבע מתוך נדידה או יישור כיווניים, סיבוב תאי, דינמיקה של השלד הציטוסקטלי ומיקום אברוני התא 7,8,9,10,11,12,13. הקמנו בדיקה מבוססת מיקרו-פטרינגשל 14 כדי לאפיין ביעילות את ההטיה הכיראלית של תאים דביקים 7,8,9,10. כאשר המיקרו-פטרנים בצורת טבעת מגבילים באופן גיאומטרי את צבירי התאים, התאים מפגינים יחד נדידה כיוונית ויישור מוטה. תוכנית MATLAB פותחה כדי לזהות ולמדוד באופן אוטומטי את יישור התאים בתמונות של ניגודיות פאזה של הטבעת. כיוון יישור התאים המקומיים מכמת בזווית מוטה, בהתאם לסטייתו מהכיוון ההיקפי. לאחר ניתוח סטטיסטי, תבנית הטבעת של התאים מוגדרת כהטיות נגד כיוון השעון (CCW) או כהטיות בכיוון השעון (CW).
בדיקה זו שימשה לאפיון הכיראליות של פנוטיפים של תאים מרובים (טבלה 1), והאסימטריה LR של תאים נמצאה כ-7,11,15 ספציפיים לפנוטיפ. יתר על כן, הפרעה לדינמיקה ולמורפולוגיה של אקטין יכולה לגרום להיפוך של הטיה כיראלית 7,8, ועקה חמצונית יכולה לשנות גם את כיראליותהתאים 9. בגלל הפשטות של ההליך והחוסן של הגישה 7,8,9,10, בדיקת כיראליות דו-ממדית זו מספקת כלי יעיל ואמין לקביעה ולימוד כיראליות רב-תאית במבחנה.
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש בשיטה זו כדי לאפיין את כיראליות התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר מערכים תאיים עם דוגמאות באמצעות טכניקת הדפסה מיקרו-קונטקונטקטית ולבצע ניתוח כיראליות באופן אוטומטי באמצעות תוכנית MATLAB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

כיראליות היא תכונה תאית פנימית, המתארת את האסימטריה במונחים של קיטוב לאורך ציר שמאל-ימין של התא. מכיוון שתכונה ייחודית זו מושכת תשומת לב גוברת בשל תפקידיה החשובים הן בהתפתחות והן במחלות, שיטת כימות סטנדרטית לאפיון כיראליות תאים תקדם את המחקר ואת היישומים הפוטנציאליים. בפרוטוקול זה אנו מתארים בדיקה של אפיון כיראליות רב-תאית המשתמשת במערכים מיקרו-פטרתיים של תאים. מיקרו-פטרנים סלולריים מיוצרים על שקופיות זכוכית מצופים טיטניום/זהב באמצעות הדפסה מיקרו-קונקרטית. לאחר זריעה על האיים המוגדרים באופן גיאומטרי (למשל, בצורת טבעת), המצופים בחלבון, התאים נודדים בכיוון ויוצרים יישור מוטה לכיוון הכיוון השעון או לכיוון נגד כיוון השעון, אותו ניתן לנתח ולכמת באופן אוטומטי על ידי תוכנית MATLAB שנכתבה בהתאמה אישית. כאן אנו מתארים בפירוט את הייצור של מצעים micropatterned, זריעת תאים, איסוף תמונות וניתוח נתונים ומציגים תוצאות מייצגות שהושגו באמצעות תאי NIH/3T3. פרוטוקול זה אומת בעבר במספר מחקרים שפורסמו והוא כלי יעיל ואמין לחקר כיראליות תאים במבחנה.

רבע שעה לאחר זריעת תאי NIH/3T3, הידבקות התאים בתבנית הטבעת אושרה חזותית על ידי הדמיית ניגודיות פאזה. לאחר תרבית מאוחרת יותר של 24 שעות, התאים על התבניות התכנסו והתארכו עם יישורים א-סימטריים בעליל, מוטים לכיוון הכיוון השעון (איור 2). נדידה כיוונית של תאים מחוברים נרשמת על ידי הדמי?...

Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

אנו מציגים פרוטוקול לקביעת כיראליות רב-תאית במבחנה, תוך שימוש בטכניקת המיקרו-פטרינג. בדיקה זו מאפשרת כימות אוטומטי של הטיות שמאל-ימין של סוגים שונים של תאים וניתן להשתמש בה למטרות סינון.

בדיקת מיקרו-פטרנינג למדידת כיראליות תאים

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

בדיקת כיראליות תאי באסט מיקרו-פטרנינג היא כלי רב עוצמה לחקר מורפוגנזה כיראלית רב-תאית בהתפתחות מחלות. זה חשוב גם למחקר בתאים. מערכת macropattern זו קלה לייצור ולשימוש, מסוגלת להפיק תוצאות אמינות ביותר וניתנות לחזרה, והיא גם תואמת לעיבוד אוטומטי בתפוקה גבוהה לגודל מדגם גדול.התחילו בחיתוך המגלשה המצופה בזהב טיטניום לחתיכות מרובעות קטנות בגודל של כ-12 על 12 מילימטרים. באמצעות חותך זכוכית, החליקו על פני השטח כדי להשאיר מסילה מעוותת, ואז החזיקו את מגלשת הזכוכית משני הצדדים והתכופפו לעבר השקע כדי לפרוץ לרבעים קטנים. כדי לנקות את המגלשה, משרים אותה עם הצד המוזהב כלפי מעלה ב-100% אתנול הכלול בצלחת פטרי על שייקר מסלולי למשך 10 דקות לפחות.לאחר שאיפת האתנול, ייבשו את המגלשה על ידי נשיפה עם זרם חנקן. נקו את חותמות הפולידימתילסילוקסן או PDMS במי סבון לפני ייבוש החותמת בגז חנקן. ממיסים 5.74 מיליגרם של אוקטאדקנתיול או C18 ב-10 מיליליטרים של 100% אתנול כדי ליצור תמיסת C18 של שני מילימולר, ולאחר מכן מנקים את חותמות ה-PDMS עם 100% אתנול.השרו את חותמת ה-PDMS כאשר משטח התבנית פונה כלפי מטה בתמיסת C18 למשך 10 שניות ולאחר מכן ייבשו אותה בעדינות בגז חנקן למשך 60 שניות. לאחר הייבוש, הניחו את הבול הפונה כלפי מטה אל מגלשת הזהב למשך 60 שניות לפני ההסרה. כדי להבטיח הטבעה נכונה, הקישו בעדינות על הפינצטה על החותמת כדי להעביר את התבניות כראוי.לאחר מכן, הכינו את תאי הלחות על ידי צנרת מיליליטר אחד של 70% אתנול למכסה צלחת פטרי הפוך. ובעזרת הפינצטה, הניחו חתיכת פרפילם כדי לכסות את פני השטח ולהבטיח שלא יישארו בועות. הסר את האתנול העודף במידת הצורך.הוסיפו 40 טיפות מיקרוליטר של תמיסת EG3 עבור כל רבע החלקת זכוכית על הפרפילם בתא הלחות, והשאירו מספיק מקום בין הטיפות כדי לקחת בחשבון את המרווח של שקופיות הזהב. השתמש בפינצטה כדי למקם את שקופית הזהב המודפסת C18 הפונה כלפי מטה אל הטיפה, ולהבטיח שלא יישארו בועות מתחת לשקופית. דחפו בעדינות את המגלשות זו לזו מבלי להרים אותן כדי למזער את האידוי.לאחר אטימת צלחת הפטרי בחוזקה עם פרפילם, השאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות. בארון בטיחות ביולוגית, משרים ושוטפים את מגלשת הזהב הפונה כלפי מעלה שלוש פעמים ב-70% אתנול כדי להסיר EG3, ואז משאירים את האתנול למשך 10 דקות לעיקור. לאחר שאיפת האתנול, הוסיפו PBS סטרילי.הכינו תא לחות נוסף עם PBS במקום אתנול כפי שהודגם. לאחר מכן, הוסיפו 50 טיפות מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין עבור כל רבע החלקה על הפרפילם, והשאירו רווח מסוים בין הטיפות. לאחר מכן הניחו את המגלשה הפונה כלפי מטה אל הטיפה כפי שהוכח קודם לכן והשאירו את צלחת הפטרי בארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות.לאחר שטיפת המגלשה המצופה זהב, הניחו את המגלשה הפונה כלפי מעלה ב-PBS. לפני זריעת התאים, חממו את המדיה והטריפסין באמבט מים התמזג בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לחיבור טוב יותר של התאים, משרים את שקופית התבנית בצלחת בת 12 בארות המכילה מדיית תרבית ומחממים אותה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.לאחר שהתאים עוברים טריפסיניזציה, מנטרלים את התאים עם FBS המכיל מדיה, מפילים את התאים ב-100 פעמים G למשך שלוש דקות ואז מנצלים מחדש את גלולת התא במדיה טרייה. לספור את התאים ולדלל את תרחיף התא כדי להשיג את הריכוז של 200, 000 תאים למיליליטר. הוסיפו 0.5 מיליליטרים של תרחיף התא לכל באר המכילה מגלשת זהב אחת.יש לנער בעדינות את הצלחת מספר פעמים לצורך זריעת תאים אחידה לפני דגירה למשך 15 דקות לחיבור התא. לאחר 15 דקות, בדוק את חיבור התא תחת מיקרוסקופ, ובמידת הצורך, דגירה למשך זמן נוסף. לאחר חיבור התאים, שאפו החוצה את המדיה המכילה תאים לא מחוברים מכל באר והוסיפו מיליליטר אחד של מדיית תרבית טרייה.תרבית את התאים באינקובטור במשך 24 שעות ובדוק את המפגש כדי לקבוע אם נוצרה כיראליות. כאשר המפגש הנדרש מושג, תקן את התאים על ידי הסרת מדיית התרבית. לאחר שטיפה עם PBS פעם אחת, הוסיפו תמיסת פרפורמלדהיד של 4% למגלשה ודגמו את טמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני השטיפה שוב עם PBS שלוש פעמים.כדי להשיג את התמונות, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם פונקציונליות המצלמה וצלם כל טבעת בשקופית ברזולוציה גבוהה. לאפיון כיראליות, הורד את קבצי הקוד של MATLAB, הוסף את תיקיית הקוד ואת תיקיות המשנה לנתיב MATLAB ופתח את ROI_selection. קובץ m.בשורה הרביעית, שנה את הספריה לתיקיית הנתונים הרצויה. שנה את גודל התמונה בשורה 14 כאשר שתי הדמויות הראשונות מייצגות את גודל העיגול הפנימי של הטבעת בעוד שהשתיים האחרות מייצגות את החיצוני. כדי לקבוע את אזור העניין או ההחזר על ההשקעה בתמונות ניגודיות הפאזה, הפעל את קוד MATLAB ROI_selection.m על ידי לחיצה על לחצן הפעלה. גררו ידנית את ריבוע הבחירה כך שיתאים לטבעת, ולאחר מכן לחצו פעמיים על התמונה כדי לאשר את הבחירה. לאחר בחירת ROI מכל התמונות בתיקייה, ייווצר קובץ Mat כדי לאחסן את פרטי ההחזר על ההשקעה עבור כל תמונה.לאחר מכן פתח את analysis_batch. m קובץ ושנה את ספריית התיקיה כפי שהודגם קודם לכן. לחץ על כפתור ההפעלה כדי לבצע את analysis_batch הקוד.m כדי לקבוע את הכיראליות של תבניות טבעת תאיות מרובות. A datatoexcel. קובץ txt ייווצר המכיל נתונים סטטיסטיים מעגליים עבור כל טבעת, כמו גם את המספרים של טבעות לא כיראליות ואנטי כיוון השעון נגד כיוון השעון.הממצאים הנוכחיים מדגימים את התועלת של בדיקת כיראליות תבנית הטבעת שפותחה באופן ניסיוני, כמו גם את הרגישות של מבחן זה לשינויים בשלד הציטוסקלטון. במחקר הנוכחי, נמצא כי על ידי שיבוש הפילמור של אקטין עם 50 טיפול latrunculin A ננומולרי, תאי המיובלסט C2C12 של העכבר הפגינו שינוי של הטיה כיראלית נגד כיוון השעון או CCW לתוספת של כיוון השעון או CW.In, תאי האנדותל של כלי הדם הטבוריים האנושיים או hUVECs שטופלו ב-12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate או TPA כדי להפעיל את החלבון קינאז C הציגו העברה תלוית מינון של כיראליות התא מ-CW ל-CCW. לאחר זריעת תאים לדפוסים, ניתן להשלים כימיקלים או תרופות למדיום כדי לחקור את התגובה, וניתן לשלב את מערכת transwell כדי לחקור תרבית משותפת של תאים.בדיקה זו מספקת כלי יעיל לחקר כיראליות רב-תאית תחת מסגרות ניסוי שונות ומציעה תובנות חשובות לגבי תפקידה של כיראליות התא בתופעות ותהליכים ביולוגיים שונים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

זיכרון צורה פולימרים לתרבות התא הפעיל

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...