Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
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इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (OD / NICHD DP2HD083961 और NHBLI R01HL148104) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लियो क्यू वान बायोमेडिकल साइंसेज (PEW 00026185) में एक प्यू स्कॉलर है, जो प्यू चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित है। हाओकांग झांग अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन प्रीडॉक्टोरल फैलोशिप (20PRE35210243) द्वारा समर्थित है।

1. polydimethylsiloxane (PDMS) टिकटोंके निर्माण 16
<ol><li>250 μm के एक आंतरिक व्यास और 450 μm के एक बाहरी व्यास के साथ, सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर माइक्रोस्केल छल्ले की एक सरणी ड्रा। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प?...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

यहाँ वर्णित अंगूठी के आकार के पैटर्निंग परख बहुकोशिकीय chirality के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक आसान करने के लिए उपयोग उपकरण प्रदान करता है, अत्यधिक विश्वसनीय और repeatable परिणामों का उत्पादन करने में सक्षम...

सेल के बाएं-दाएं (एलआर) विषमता, जिसे सेलुलर हैंडनेस या चिरलिटी के रूप में भी जाना जाता है, एलआर अक्ष में सेल ध्रुवीयता का वर्णन करता है और इसे एक मौलिक, संरक्षित, बायोफिजिकल संपत्ति 1,2,3,4,5 माना जाता है। सेल chirality विवो और इन विट्रो दोनों में कई पैमाने पर देखा गया है। पिछले निष्कर्षों से पता चला कि परिपत्रद्वीपों 6 पर सीडेड एकल कोशिकाओं में एक्टिन साइटोस्केलेटन के चिरल घूमते हुए, पक्षपाती प्रवास और सीमित सीमाओं के भीतर कोशिकाओं का संरेखण 7,8,9,10,11, और चिकन हीट ट्यूब12 के विषम लूपिंग।
बहुकोशिकीय स्तर पर, सेल चिरलता को दिशात्मक प्रवास या संरेखण, सेलुलर रोटेशन, साइटोस्केलेटल गतिशीलता और सेल ऑर्गेनेल पोजिशनिंग 7,8,9,10,11,12,13 से निर्धारित किया जा सकता है। हम एक micropatterning आधारित 14 परख की स्थापना की है कुशलतापूर्वक अनुयायी कोशिकाओं के चिरल पूर्वाग्रह 7,8,9,10 की विशेषता है. रिंग के आकार के माइक्रोपैटर्न ज्यामितीय रूप से सीमित सेल क्लस्टर के साथ, कोशिकाएं सामूहिक रूप से दिशात्मक प्रवास और पक्षपाती संरेखण का प्रदर्शन करती हैं। एक MATLAB कार्यक्रम स्वचालित रूप से पता लगाने और अंगूठी के चरण-विपरीत छवियों में सेल संरेखण को मापने के लिए विकसित किया गया था। स्थानीय सेल संरेखण की दिशा को एक पक्षपाती कोण के साथ परिमाणित किया जाता है, जो परिधीय दिशा से इसके विचलन पर निर्भर करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद, कोशिकाओं के रिंग पैटर्न को या तो वामावर्त (सीसीडब्ल्यू) पूर्वाग्रहों या दक्षिणावर्त (सीडब्ल्यू) पूर्वाग्रहों के रूप में नामित किया जाता है।
इस परख का उपयोग कई सेल फेनोटाइप (तालिका 1) की चिरलता को चिह्नित करने के लिए किया गया है, और कोशिकाओं की एलआर विषमता को फेनोटाइप-विशिष्ट 7,11,15 पाया गया है। इसके अलावा, एक्टिन गतिशीलता और आकृति विज्ञान में व्यवधान के परिणामस्वरूप चिरल पूर्वाग्रह 7,8 के उलट हो सकते हैं, और ऑक्सीडेटिव तनाव सेल चिरलिटी को भी बदल सकता है। प्रक्रिया की सादगी औरदृष्टिकोण की मजबूती के कारण 7,8,9,10, यह 2 डी chirality परख निर्धारित करने और विट्रो में बहुकोशिकीय chirality का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सेल चिरलता को चिह्नित करने के लिए इस विधि के उपयोग को प्रदर्शित करना है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग तकनीक के माध्यम से पैटर्न वाले सेलुलर सरणियों को कैसे बनाया जाए और MATLAB प्रोग्राम का उपयोग करके स्वचालित फैशन में चिरलिटी विश्लेषण किया जाए।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

चिरलता एक आंतरिक सेलुलर संपत्ति है, जो सेल के बाएं-दाएं अक्ष के साथ ध्रुवीकरण के संदर्भ में विषमता को दर्शाती है। चूंकि यह अद्वितीय संपत्ति विकास और बीमारी दोनों में अपनी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण बढ़ते ध्यान को आकर्षित करती है, इसलिए सेल चिरलता की विशेषता के लिए एक मानकीकृत परिमाणीकरण विधि अनुसंधान और संभावित अनुप्रयोगों को आगे बढ़ाएगी। इस प्रोटोकॉल में, हम एक बहुकोशिकीय chirality लक्षण वर्णन परख है कि कोशिकाओं के micropatterned सरणियों का उपयोग करता है का वर्णन. सेलुलर माइक्रोपैटर्न को माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के माध्यम से टाइटेनियम / गोल्ड-लेपित ग्लास स्लाइड पर बनाया जाता है। ज्यामितीय रूप से परिभाषित (जैसे, अंगूठी के आकार के), प्रोटीन-लेपित द्वीपों पर सीडिंग के बाद, कोशिकाएं दिशात्मक रूप से माइग्रेट होती हैं और दक्षिणावर्त या वामावर्त दिशा की ओर एक पक्षपाती संरेखण बनाती हैं, जिसे स्वचालित रूप से एक कस्टम-लिखित MATLAB प्रोग्राम द्वारा विश्लेषण और परिमाणित किया जा सकता है। यहां हम माइक्रोपैटर्न्ड सब्सट्रेट्स, सेल सीडिंग, छवि संग्रह और डेटा विश्लेषण के निर्माण का विस्तार से वर्णन करते हैं और एनआईएच / 3 टी 3 कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल को पहले कई प्रकाशित अध्ययनों में मान्य किया गया है और विट्रो में सेल चिरलिटी का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण है।

एनआईएच / 3टी 3 कोशिकाओं के सीडिंग के पंद्रह मिनट बाद, रिंग पैटर्न पर सेल आसंजन को चरण-विपरीत इमेजिंग द्वारा नेत्रहीन रूप से पुष्टि की गई थी। 24 घंटे की बाद की संस्कृति के बाद, पैटर्न पर कोशिकाएं स्पष्ट रूप स?...

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A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

हम माइक्रोपैटर्निंग तकनीक का उपयोग करके विट्रो में बहुकोशिकीय चिरलता का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस परख कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के बाएं-दाएं पूर्वाग्रहों के स्वचालित परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है और स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सेल Chirality को मापने के लिए एक Micropatterning परख

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

micropatterning bast सेल chirality परख रोग के विकास में बहुकोशिकीय चिरल morphogenesis का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह सेल अनुसंधान के लिए भी महत्वपूर्ण है। यह मैक्रोपैटर्न सिस्टम बनाना और उपयोग करना आसान है, अत्यधिक विश्वसनीय और दोहराने योग्य परिणाम उत्पन्न करने में सक्षम है, और यह बड़े नमूना आकार के लिए स्वचालित उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण के साथ भी संगत है।टाइटेनियम सोने लेपित स्लाइड को लगभग 12 से 12 मिलीमीटर के छोटे वर्ग टुकड़ों में काटकर शुरू करें। एक ग्लास कटर का उपयोग करके, एक डेंटेड ट्रैक छोड़ने के लिए सतह पर स्लाइड करें, फिर ग्लास स्लाइड को दोनों तरफ रखें और छोटे क्वार्टर में तोड़ने के लिए डेंट पर झुकें। स्लाइड को साफ करने के लिए, इसे कम से कम 10 मिनट के लिए कक्षीय शेकर पर पेट्री डिश में निहित 100% इथेनॉल में सोने की तरफ से भिगोएं।इथेनॉल aspirating के बाद, एक नाइट्रोजन धारा के साथ उड़ाने से स्लाइड सूखी. नाइट्रोजन गैस के साथ टिकट को सुखाने से पहले साबुन के पानी के साथ पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन या पीडीएमएस टिकटों को साफ करें। दो मिलीमोलर सी 18 समाधान बनाने के लिए 100% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर में 5.74 मिलीग्राम ऑक्टेडेकेनथिओल या सी 18 को भंग करें, फिर 100% इथेनॉल के साथ पीडीएमएस टिकटों को साफ करें।पीडीएमएस स्टैंप को 10 सेकंड के लिए C18 समाधान में नीचे की ओर सामना करने वाली पैटर्न सतह के साथ भिगोएं और फिर धीरे से इसे 60 सेकंड के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ सुखाएं। एक बार सूखने के बाद, हटाने से पहले 60 सेकंड के लिए सोने की स्लाइड पर नीचे का सामना करने वाली मुहर बिछाएं। उचित मुद्रांकन सुनिश्चित करने के लिए, पैटर्न को ठीक से स्थानांतरित करने के लिए टिकट पर चिमटी को धीरे से टैप करें।इसके बाद, एक उल्टे पेट्री डिश ढक्कन में 70% इथेनॉल के एक मिलीलीटर को पिपेट करके आर्द्रता कक्षों को तैयार करें। और चिमटी का उपयोग करते हुए, सतह को कवर करने के लिए पैराफिल्म का एक टुकड़ा रखें ताकि कोई बुलबुले न रहें। यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त इथेनॉल को हटा दें।आर्द्रता कक्ष में पैराफिल्म पर प्रत्येक तिमाही ग्लास स्लाइड के लिए ईजी 3 समाधान की 40 माइक्रोलीटर बूंदें जोड़ें, जिससे सोने की स्लाइड्स की रिक्ति के लिए खाते में बूंदों के बीच पर्याप्त जगह बची। C18 मुद्रित सोने की स्लाइड को बूंद पर नीचे का सामना करने के लिए चिमटी का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड के नीचे कोई बुलबुले नहीं रहते हैं। वाष्पीकरण को कम करने के लिए उन्हें उठाने के बिना स्लाइड को धीरे से एक साथ धक्का दें।पेट्री डिश को पैराफिल्म के साथ कसकर सील करने के बाद, इसे कम से कम तीन घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, ईजी 3 को हटाने के लिए 70% इथेनॉल में तीन बार सोने की स्लाइड को भिगोएं और कुल्ला करें, फिर नसबंदी के लिए 10 मिनट के लिए इथेनॉल में छोड़ दें। इथेनॉल aspirating के बाद, बाँझ PBS जोड़ें।इथेनॉल के बजाय पीबीएस के साथ एक और आर्द्रता कक्ष तैयार करें जैसा कि प्रदर्शित किया गया है। इसके बाद, पैराफिल्म पर प्रत्येक तिमाही स्लाइड के लिए फाइब्रोनेक्टिन समाधान की 50 माइक्रोलीटर बूंदें जोड़ें, जिससे बूंदों के बीच कुछ जगह बची हो। फिर स्लाइड को ड्रॉपलेट पर नीचे का सामना करना पड़ रहा है जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था और 30 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में पेट्री डिश को छोड़ दें।सोने को लेपित स्लाइड को तीन बार धोने के बाद, स्लाइड को पीबीएस में ऊपर की ओर रखें। कोशिकाओं को सीडिंग करने से पहले, मीडिया और ट्रिप्सिन को पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। बेहतर सेल अनुलग्नक के लिए, पैटर्न स्लाइड को 12-अच्छी तरह से प्लेट में भिगोएं जिसमें संस्कृति मीडिया शामिल है और इसे इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।एक बार कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करने के बाद, मीडिया युक्त एफबीएस के साथ कोशिकाओं को बेअसर करें, तीन मिनट के लिए 100 बार जी पर कोशिकाओं को गोली मारें और फिर ताजा मीडिया में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करें और प्रति मिलीलीटर 200, 000 कोशिकाओं की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन को पतला करें। एक सोने की स्लाइड युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 0.5 milliliters जोड़ें।सेल अनुलग्नक के लिए 15 मिनट के लिए incubating से पहले वर्दी सेल सीडिंग के लिए प्लेट को कुछ बार हिलाएं। 15 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत सेल अनुलग्नक की जांच करें, और यदि आवश्यक हो, तो कुछ और समय के लिए इनक्यूबेट करें। एक बार जब कोशिकाएं संलग्न हो जाती हैं, तो प्रत्येक अच्छी तरह से असंबद्ध कोशिकाओं वाले मीडिया को एस्पिरेट करें और ताजा संस्कृति मीडिया का एक मिलीलीटर जोड़ें।इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए संस्कृति दें और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या चिरलिटी का गठन हुआ है, कॉन्फ्लुएंसी की जांच करें। जब आवश्यक confluency प्राप्त किया जाता है, तो संस्कृति मीडिया को हटाकर कोशिकाओं को ठीक करें। एक बार पीबीएस के साथ कुल्ला करने के बाद, स्लाइड में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान जोड़ें और पीबीएस के साथ तीन बार फिर से धोने से पहले 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान को इनक्यूबेट करें।छवियों को प्राप्त करने के लिए, कैमरा कार्यक्षमता के साथ एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर स्लाइड पर प्रत्येक अंगूठी को कैप्चर करें। Chirality लक्षण वर्णन के लिए, MATLAB कोड फ़ाइलें डाउनलोड करें, MATLAB पथ के लिए कोड फ़ोल्डर और सबफ़ोल्डर जोड़ें और ROI_selection खोलें। m फ़ाइल.पंक्ति चार में, इच्छित डेटा फ़ोल्डर के लिए निर्देशिका परिवर्तित करें। पंक्ति 14 में छवि का आकार बदलें, जिसमें पहले दो आंकड़े रिंग के आंतरिक वृत्त आकार का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि अन्य दो बाहरी का प्रतिनिधित्व करते हैं। चरण विपरीत छवियों में रुचि या ROI के क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए, MATLAB कोड ROI_selection निष्पादित करें।चलाएँ बटन पर क्लिक करके m. रिंग को फिट करने के लिए चयन वर्ग को मैन्युअल रूप से खींचें, फिर चयन की पुष्टि करने के लिए छवि पर डबल क्लिक करें। फ़ोल्डर में सभी छवियों से ROI का चयन करने के बाद, प्रत्येक छवि के लिए ROI जानकारी को संग्रहीत करने के लिए एक चटाई फ़ाइल उत्पन्न की जाएगी।फिर analysis_batch खोलें। एम फ़ाइल और फ़ोल्डर की निर्देशिका को बदलने के रूप में पहले प्रदर्शित किया. analysis_batch कोड को निष्पादित करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।एम एकाधिक सेलुलर रिंग पैटर्न की chirality निर्धारित करने के लिए। एक datatoexcel. txt फ़ाइल प्रत्येक अंगूठी के लिए परिपत्र आँकड़े, साथ ही दक्षिणावर्त गैर chiral और विरोधी दक्षिणावर्त छल्ले की संख्या से युक्त उत्पन्न किया जाएगा.वर्तमान निष्कर्ष विकसित अंगूठी पैटर्न chirality परख प्रयोगात्मक रूप से के रूप में अच्छी तरह से साइटोस्केलेटन में परिवर्तन के लिए इस परख की संवेदनशीलता की उपयोगिता का प्रदर्शन. वर्तमान अध्ययन में, यह पाया गया कि 50 नैनोमोलर लैट्रुनकुलिन ए उपचार के साथ एक्टिन पोलीमराइजेशन को बाधित करके, माउस मायोब्लास्ट सी 2 सी 12 कोशिकाओं ने वामावर्त या सीसीडब्ल्यू चिरल पूर्वाग्रह को दक्षिणावर्त या CW.In इसके अलावा में परिवर्तन का प्रदर्शन किया, मानव नाभि संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं या एचयूवीईसी जिन्हें 12-ओ-टेट्राडेकैनोयल-फोरबोल-13-एसीटेट या टीपीए के साथ इलाज किया गया था, प्रोटीन किनेज सी को सक्रिय करने के लिए सीडब्ल्यू से सेल चिरलता की खुराक-निर्भर बदलाव प्रदर्शित किया गया था। पैटर्न के लिए सेल सीडिंग के बाद, रसायनों या दवाओं को प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए माध्यम में पूरक किया जा सकता है, और ट्रांसवेल सिस्टम को सेल सह-संस्कृति का अध्ययन करने के लिए शामिल किया जा सकता है।इस परख विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स के तहत बहुकोशिकीय chirality की जांच के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है विभिन्न जैविक घटनाओं और प्रक्रियाओं में सेल chirality की भूमिका में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

सक्रिय सेल संस्कृति आकार मेमोरी पॉलिमर

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypic कोलेजन मैं परख: एक निंदनीय के लिए एक संदर्भ 3 आयामी में सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए एक मंच

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

प्रोटीन और सेल बन्दिश के लिए दो आयामी नमूनों Substrates बनाना

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

मानव सेल संस्कृति घूर्णन सेल संस्कृति सिस्टम: एक मॉडल के रूप में मानव ट्रोफोब्लास्ट कक्ष

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक गुण मापने

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection घाव परख और<em&gt; में विवो</em&gt; एपिडर्मल का स्थानीयकरण रिस्पांस रिपोर्टर में घाव<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-pMHC बंधन मापने<em&gt; बगल में</em&gt; एक झल्लाहट आधारित माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning और 3 डी microvessels के विधानसभा

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3 डी सेल संस्कृति के लिए पल्मोनरी बाह्य मैट्रिक्स से Tunable Hydrogels

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...