Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 e NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan è un Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), supportato dal Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang è supportato dall'American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).

1. Fabbricazione di francobolli polidimetilsilossano (PDMS)16
<ol><li>Disegna una serie di anelli su microscala utilizzando il software CAD, con un diametro interno di 250 μm e un diametro esterno di 450 μm. Il modello utilizzato in questo protocollo è un array 10 x 10 con una distanza di 850 μm tra gli anelli.</li>
	<li>Stampare una maschera di trasparenza del modello alla risoluzione desiderata utilizzando il servizio di stampa di maschere di un'azienda di microfabbricazione (vedere <stron...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

Il test di patterning a forma di anello qui descritto fornisce uno strumento di facile utilizzo per la caratterizzazione quantitativa della chiralità multicellulare, in grado di produrre risultati altamente affidabili e ripetibili. La rapida generazione di microambienti identici definiti e l'analisi imparziale consentono l'elaborazione automatizzata ad alta produttività di campioni di grandi dimensioni. Questo protocollo discute la fabbricazione dei micropattern ad anello, il pattern cellulare e l'analisi automatica de...

L'asimmetria sinistra-destra (LR) della cellula, nota anche come manualità cellulare o chiralità, descrive la polarità cellulare nell'asse LR ed è riconosciuta come una proprietà biofisica fondamentale, conservata, 1,2,3,4,5. La chiralità cellulare è stata osservata sia in vivo che in vitro su più scale. Precedenti risultati hanno rivelato il vortice chirale del citoscheletro di actina in singole cellule seminate su isole circolari6, la migrazione distorta e l'allineamento delle cellule entro i confiniconfinati 7,8,9,10,11 e il loop asimmetrico del tubo di calore di pollo12.
A livello multicellulare, la chiralità cellulare può essere determinata dalla migrazione direzionale o dall'allineamento, dalla rotazione cellulare, dalla dinamica citoscheletrica e dal posizionamento degli organelli cellulari 7,8,9,10,11,12,13. Abbiamo stabilito un test14 basato sulla micropatterning per caratterizzare in modo efficiente il bias chirale delle celluleaderenti 7,8,9,10. Con i micropattern a forma di anello che confinano geometricamente i cluster cellulari, le cellule mostrano collettivamente una migrazione direzionale e un allineamento distorto. È stato sviluppato un programma MATLAB per rilevare e misurare automaticamente l'allineamento delle celle nelle immagini a contrasto di fase dell'anello. La direzione dell'allineamento cellulare locale è quantificata con un angolo distorto, a seconda della sua deviazione dalla direzione circonferenziale. A seguito di analisi statistica, il modello ad anello delle celle viene designato come bias in senso antiorario (CCW) o bias in senso orario (CW).
Questo test è stato utilizzato per caratterizzare la chiralità di più fenotipi cellulari (Tabella 1) e l'asimmetria LR delle cellule è risultata essere fenotipo-specifica 7,11,15. Inoltre, l'interruzione della dinamica e della morfologia dell'actina può provocare un'inversione del bias chirale 7,8 e lo stress ossidativo può alterare anche la chiralità cellulare9. A causa della semplicità della procedura e della robustezza dell'approccio 7,8,9,10, questo test di chiralità 2D fornisce uno strumento efficiente e affidabile per determinare e studiare la chiralità multicellulare in vitro.
Lo scopo di questo protocollo è dimostrare l'uso di questo metodo per caratterizzare la chiralità cellulare. Questo protocollo descrive come fabbricare array cellulari modellati tramite la tecnica di stampa a microcontatto e condurre analisi di chiralità in modo automatizzato utilizzando il programma MATLAB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

La chiralità è una proprietà cellulare intrinseca, che raffigura l'asimmetria in termini di polarizzazione lungo l'asse sinistro-destro della cellula. Poiché questa proprietà unica attira sempre più attenzione a causa dei suoi ruoli importanti sia nello sviluppo che nella malattia, un metodo di quantificazione standardizzato per caratterizzare la chiralità cellulare farebbe progredire la ricerca e le potenziali applicazioni. In questo protocollo, descriviamo un test di caratterizzazione della chiralità multicellulare che utilizza array di cellule micropatterned. I micropattern cellulari sono fabbricati su vetrini rivestiti in titanio / oro tramite stampa a microcontatto. Dopo la semina sulle isole geometricamente definite (ad esempio, a forma di anello) rivestite di proteine, le cellule migrano direzionalmente e formano un allineamento distorto verso la direzione in senso orario o antiorario, che può essere automaticamente analizzato e quantificato da un programma MATLAB scritto su misura. Qui descriviamo in dettaglio la fabbricazione di substrati micropatterned, la semina cellulare, la raccolta di immagini e l'analisi dei dati e mostriamo risultati rappresentativi ottenuti utilizzando le celle NIH / 3T3. Questo protocollo è stato precedentemente convalidato in diversi studi pubblicati ed è uno strumento efficiente e affidabile per lo studio della chiralità cellulare in vitro.

Quindici minuti dopo la semina delle cellule NIH/3T3, l'adesione cellulare sul modello ad anello è stata confermata visivamente dall'imaging a contrasto di fase. Dopo la successiva coltura di 24 ore, le cellule sui modelli sono diventate confluenti e allungate con allineamenti chiaramente asimmetrici, sbilanciati verso la direzione in senso orario (Figura 2). La migrazione direzionale delle cellule attaccate viene registrata mediante imaging time-lapse, la motilità cellulare e la morfogene...

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A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

Presentiamo un protocollo per la determinazione della chiralità multicellulare in vitro, utilizzando la tecnica del micropatterning. Questo test consente la quantificazione automatica dei bias sinistra-destra di vari tipi di cellule e può essere utilizzato a scopo di screening.

Un test di micropatterning per la misurazione della chiralità cellulare

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

Il test di chiralità delle cellule bast di micropatterning è un potente strumento per studiare la morfogenesi chirale multicellulare nello sviluppo della malattia. È anche importante per la ricerca cellulare. Questo sistema macropattern è facile da fabbricare e utilizzare, è in grado di produrre risultati altamente affidabili e ripetibili ed è anche compatibile con l'elaborazione automatizzata ad alta produttività per campioni di grandi dimensioni.Inizia tagliando il vetrino rivestito in titanio dorato in piccoli pezzi quadrati di circa 12 per 12 millimetri. Usando una fresa per vetro, fai scorrere la superficie per lasciare una traccia ammaccata, quindi tieni la diapositiva di vetro su entrambi i lati e piegati sull'ammaccatura per romperla in piccoli quarti. Per pulire la diapositiva, immergerla con il lato dorato in etanolo al 100% contenuto in una capsula di Petri su uno shaker orbitale per almeno 10 minuti.Dopo aver aspirato l'etanolo, asciugare il vetrino soffiando con un flusso di azoto. Pulire i timbri polidimetilsilossano o PDMS con acqua saponata prima di asciugare il timbro con azoto gassoso. Sciogliere 5,74 milligrammi di ottadecanetiolo o C18 in 10 millilitri di etanolo al 100% per ottenere due soluzione millimolare C18, quindi pulire i timbri PDMS con etanolo al 100%.Immergere il timbro PDMS con la superficie del modello rivolta verso il basso nella soluzione C18 per 10 secondi e quindi asciugarlo delicatamente con azoto gassoso per 60 secondi. Una volta asciugato, posare il timbro rivolto verso il basso sul vetrino d'oro per 60 secondi prima della rimozione. Per garantire una corretta stampa, picchiettare delicatamente le pinzette sul timbro per trasferire correttamente i motivi.Quindi, preparare le camere di umidità pipettando un millilitro di etanolo al 70% in un coperchio invertito della capsula di Petri. E usando le pinzette, stendere un pezzo di parafilm per coprire la superficie assicurandosi che non rimangano bolle. Rimuovere l'etanolo in eccesso, se necessario.Aggiungere 40 goccioline di microlitro di soluzione EG3 per ogni quarto di vetrino sul parafilm nella camera di umidità, lasciando spazio sufficiente tra le goccioline per tenere conto della spaziatura delle diapositive dorate. Usa una pinzetta per posizionare la diapositiva d'oro stampata C18 rivolta verso il basso sulla goccia, assicurandoti che non rimangano bolle sotto la diapositiva. Spingere delicatamente le diapositive insieme senza sollevarle per ridurre al minimo l'evaporazione.Dopo aver sigillato saldamente la capsula di Petri con parafilm, lasciarla a temperatura ambiente per almeno tre ore. In un armadietto di biosicurezza, immergere e risciacquare il vetrino d'oro rivolto verso l'alto tre volte in etanolo al 70% per rimuovere EG3, quindi lasciare in etanolo per 10 minuti per la sterilizzazione. Dopo aver aspirato l'etanolo, aggiungere PBS sterile.Preparare un'altra camera di umidità con PBS invece di etanolo come dimostrato. Quindi, aggiungere 50 goccioline di microlitro di soluzione di fibronectina per ogni quarto scivolare sul parafilm, lasciando un po 'di spazio tra le goccioline. Quindi posizionare la diapositiva rivolta verso il basso sulla goccia come dimostrato in precedenza e lasciare la capsula di Petri nell'armadio di biosicurezza per 30 minuti.Dopo aver risciacquato tre volte il vetrino rivestito in oro, posizionare il vetrino rivolto verso l'alto in PBS. Prima di seminare le cellule, riscaldare il mezzo e la tripsina a bagnomaria temperati a 37 gradi Celsius. Per un migliore fissaggio cellulare, immergere la diapositiva del modello in una piastra a 12 pozzetti contenente terreni di coltura e riscaldarla a 37 gradi Celsius nell'incubatore.Una volta che le cellule sono tripsinizzate, neutralizzare le cellule con mezzi contenenti FBS, pellet giù le cellule a 100 volte G per tre minuti e quindi risospese il pellet cellulare in mezzi freschi. Contare le cellule e diluire la sospensione cellulare per raggiungere la concentrazione di 200.000 cellule per millilitro. Aggiungere 0,5 millilitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto contenente un vetrino d'oro.Agitare delicatamente la piastra un paio di volte per la semina cellulare uniforme prima di incubare per 15 minuti per l'attaccamento cellulare. Dopo 15 minuti, controllare l'attacco cellulare al microscopio e, se necessario, incubare per un altro po 'di tempo. Una volta che le cellule sono attaccate, aspirare il mezzo contenente cellule non attaccate da ciascun pozzetto e aggiungere un millilitro di terreno di coltura fresco.Coltiva le cellule nell'incubatore per 24 ore e controlla la confluenza per determinare se si è formata la chiralità. Quando viene raggiunta la confluenza richiesta, fissare le celle rimuovendo il terreno di coltura. Dopo aver risciacquato con PBS una volta, aggiungere la soluzione di paraformaldeide al 4% al vetrino e incubare la temperatura ambiente per 15 minuti prima di risciacquare nuovamente con PBS tre volte.Per acquisire le immagini, utilizzare un microscopio a contrasto di fase con funzionalità della fotocamera e catturare ogni anello sul vetrino ad alta risoluzione. Per la caratterizzazione della chiralità, scarica i file di codice MATLAB, aggiungi la cartella del codice e le sottocartelle al percorso MATLAB e apri il ROI_selection. m file.Nella riga quattro, modificare la directory nella cartella di dati desiderata. Modificare le dimensioni dell'immagine nella riga 14 con le prime due figure che rappresentano la dimensione del cerchio interno dell'anello mentre le altre due rappresentano l'esterno. Per determinare la regione di interesse o il ROI nelle immagini a contrasto di fase, esegui il codice MATLAB ROI_selection.m facendo clic sul pulsante Esegui. Trascina manualmente il quadrato di selezione per adattarlo all'anello, quindi fai doppio clic sull'immagine per confermare la selezione. Dopo aver selezionato il ROI da tutte le immagini nella cartella, verrà generato un file mat per memorizzare le informazioni sul ROI per ogni immagine.Quindi aprire il analysis_batch. m e modificare la directory della cartella come illustrato in precedenza. Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il codice analysis_batch.m per determinare la chiralità di più modelli di anelli cellulari. A datatoexcel. Verrà generato un file txt contenente statistiche circolari per ogni anello, nonché i numeri di anelli non chirali e antiorario in senso orario.I risultati attuali dimostrano l'utilità del test di chiralità del modello ad anello sviluppato sperimentalmente e la sensibilità di questo test alle alterazioni del citoscheletro. Nel presente studio, è stato scoperto che interrompendo la polimerizzazione dell'actina con 50 nanomolari latrunculinA A trattamento, le cellule del mioblasto di topo C2C12 hanno mostrato un'alterazione del bias chirale in senso antiorario o CCW in senso orario o CW.In aggiunta, le cellule endoteliali vascolari ombelicali umane o hUVECs che sono state trattate con 12-o-tetradecanoil-forbol-13-acetato o TPA per attivare la proteina chinasi C hanno mostrato uno spostamento dose-dipendente della chiralità cellulare da CW a CCW. Dopo la semina cellulare ai modelli, sostanze chimiche o farmaci possono essere integrati al mezzo per studiare la risposta e il sistema transwell può essere incorporato per studiare la co-coltura cellulare.Questo test fornisce uno strumento efficace per studiare la chiralità multicellulare in diversi contesti sperimentali e offre importanti approfondimenti sul ruolo della chiralità cellulare in vari fenomeni e processi biologici.

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