Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
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이 연구는 국립 보건원 (OD / NICHD DP2HD083961 및 NHBLI R01HL148104)이 자금을 지원했습니다. Leo Q. Wan은 Pew Charitable Trusts의 지원을 받는 생명의학 분야의 퓨 학자(PEW 00026185입니다. Haokang Zhang은 American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243)의 지원을 받습니다.

1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 우표 제작16
<ol><li>CAD 소프트웨어를 사용하여 내경이 250μm이고 외경이 450μm인 마이크로스케일 링 어레이를 그립니다. 이 프로토콜에 사용되는 패턴은 고리 사이의 거리가 850μm인 10 x 10 어레이입니다.</li>
	<li>미세 제조 회사의 마스크 인쇄 서비스를 사용하여 패턴의 투명도 마스크를 원하는 해상도로 인쇄 하십시오 (자료 표 참조). 참고: ...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

여기에 설명된 고리형 패터닝 분석은 매우 안정적이고 반복 가능한 결과를 생성할 수 있는 다세포 키랄성의 정량적 특성화를 위한 사용하기 쉬운 도구를 제공합니다. 동일한 정의된 미세 환경의 신속한 생성과 편향되지 않은 분석을 통해 대용량 샘플의 자동화된 고처리량 처리가 가능합니다. 이 프로토콜은 링 마이크로패턴의 제작, 셀 패터닝 및 편향된 셀 정렬 및 방향 운동의 자동 분석에 대해 ...

세포의 좌우(LR) 비대칭성(세포 손 또는 키랄성이라고도 함)은 LR 축의 세포 극성을 기술하며 근본적이고 보존된 생물물리학적 특성 1,2,3,4,5로 인식된다. 세포 키랄성은 다수의 스케일에서 생체내 및 시험관내 둘 다에서 관찰되었다. 이전의 발견은 원형 섬6에 시달린 단일 세포에서 액틴 세포 골격의 키랄 소용돌이, 제한된 경계 7,8,9,10,11 내의 세포의 편향된 이동 및 정렬, 닭 히트 튜브 12의 비대칭 루핑을 밝혀냈다.
다세포 수준에서, 세포 키랄성은 방향성 이동 또는 정렬, 세포 회전, 세포골격 역학, 및 세포 소기관 위치7,8,9,10,11,12,13으로부터 결정될 수 있다. 우리는 부착성 세포 7,8,9,10의 키랄 편향을 효율적으로 특성화하기 위해 마이크로 패 터닝 기반 14 검정을 확립했습니다. 기하학적으로 제한된 세포 군집을 갖는 고리 모양의 마이크로패턴으로, 세포는 집합적으로 방향성 이동 및 편향된 정렬을 나타낸다. MATLAB 프로그램은 링의 위상차 이미지에서 세포 정렬을 자동으로 감지하고 측정하기 위해 개발되었습니다. 국소 세포 정렬의 방향은 원주 방향으로부터의 편차에 따라 편향된 각도로 정량화된다. 통계적 분석에 따라, 세포의 고리 패턴은 시계 반대 방향(CCW) 바이어스 또는 시계 방향(CW) 바이어스로 지정된다.
이 분석은 다중 세포 표현형의 키랄성을 특성화하기 위해 사용되었으며(표 1), 세포의 LR 비대칭성은 표현형-특이적 7,11,15인 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 액틴 역학 및 형태학에 대한 붕괴는 키랄 편향7,8의 역전을 초래할 수 있고, 산화 스트레스는 세포 키랄성도 변화시킬 수 있다9. 절차 의 단순성과 접근법 7,8,9,10의 견고성 때문에, 이 2D 키랄성 분석은 시험관 내에서 다세포 키랄성을 결정하고 연구하기 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 도구를 제공한다.
이 프로토콜의 목적은 세포 키랄성을 특성화하기 위해 이 방법의 사용을 입증하는 것이다. 이 프로토콜은 마이크로 접촉 인쇄 기술을 통해 패턴화된 세포 어레이를 제작하고 MATLAB 프로그램을 사용하여 자동화된 방식으로 키랄성 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

키랄성은 세포의 왼쪽 - 오른쪽 축을 따라 편광의 관점에서 비대칭을 묘사하는 고유 한 세포 특성입니다. 이 독특한 특성이 발달과 질병 모두에서 중요한 역할을하기 때문에 주목을 끌기 때문에 세포 키랄성을 특성화하기위한 표준화 된 정량화 방법은 연구 및 잠재적 인 응용을 앞당길 것입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 세포의 마이크로패턴화된 어레이를 이용하는 다세포 키랄성 특성화 검정을 기술한다. 세포 마이크로 패턴은 마이크로 접촉 인쇄를 통해 티타늄 / 금 코팅 유리 슬라이드에 제작됩니다. 기하학적으로 정의된(예를 들어, 고리 모양의) 단백질 코팅된 섬들 상에 시딩한 후, 세포는 방향적으로 이동하고, 시계 방향 또는 반시계 방향 방향 중 하나를 향해 편향된 정렬을 형성하며, 이는 사용자 정의 작성된 MATLAB 프로그램에 의해 자동으로 분석 및 정량화될 수 있다. 여기서는 마이크로 패턴화 된 기질의 제작, 세포 시딩, 이미지 수집 및 데이터 분석을 자세히 설명하고 NIH / 3T3 세포를 사용하여 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 이전에 여러 발표 된 연구에서 검증되었으며 시험관 내에서 세포 키랄성을 연구하기위한 효율적이고 신뢰할 수있는 도구입니다.

NIH/3T3 세포의 시딩 15분 후, 고리 패턴에 대한 세포 부착은 위상차 영상화에 의해 육안으로 확인되었다. 24시간의 후속 배양 후에, 패턴 상의 세포들은 뚜렷하게 비대칭적인 정렬로 합류하고 길쭉해졌고, 시계 방향으로 편향되었다(그림 2). 부착된 세포의 방향성 이동은 타임랩스 영상화에 의해 기록되고, 세포 운동성 및 형태형성은 비디오의 추가 분석으로 정량화될 수 있다. ...

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A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

우리는 마이크로패터닝 기술을 사용하여 시험관 내에서 다세포 키랄성을 결정하기 위한 프로토콜을 제시한다. 이 분석은 다양한 유형의 세포의 좌-우 편향의 자동 정량화를 허용하고 스크리닝 목적으로 사용될 수 있다.

세포 키랄성 측정을 위한 마이크로패터닝 분석

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

마이크로 패터닝 bast 세포 키랄 성 분석은 질병 발달에서 다세포 키랄 형태 형성을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 그것은 또한 세포 연구에 중요합니다. 이 매크로 패턴 시스템은 제작 및 사용이 쉽고 신뢰성이 높고 반복 가능한 결과를 생성 할 수 있으며 큰 샘플 크기에 대한 자동화 된 고처리량 처리와도 호환됩니다.티타늄 금으로 코팅 된 슬라이드를 약 12 x 12 밀리미터의 작은 사각형 조각으로 절단하여 시작하십시오. 유리 커터를 사용하여 표면을 가로 질러 미끄러 져 움푹 들어간 트랙을 남긴 다음 유리 슬라이드를 양쪽으로 잡고 움푹 들어간 곳에서 구부려 작은 분기로 나눕니다. 슬라이드를 청소하려면 페트리 접시에 들어있는 100 % 에탄올에 금면을 올려 오비탈 쉐이커의 10 분 이상 담그십시오.에탄올을 흡인한 후, 질소 기류로 송풍하여 슬라이드를 건조시킨다. 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 스탬프를 질소 가스로 건조시키기 전에 비눗물로 청소하십시오. 5.74 밀리그램의 옥타데칸티올 또는 C18을 100 % 에탄올 10 밀리리터에 녹여 2 밀리몰 C18 용액을 만든 다음 PDMS 스탬프를 100 % 에탄올로 청소하십시오.패턴 표면이 아래로 향하도록 PDMS 스탬프를 C18 용액에 10초 동안 담근 다음 질소 가스로 60초 동안 부드럽게 건조시킵니다. 일단 건조되면, 제거하기 전에 60 초 동안 금 슬라이드에 우표를 아래로 향하게하십시오. 적절한 스탬핑을 보장하려면 핀셋을 스탬프에 부드럽게 탭하여 패턴을 적절하게 전달하십시오.다음으로, 70 % 에탄올 한 밀리리터를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 피펫팅하여 습도 챔버를 준비하십시오. 핀셋을 사용하여 표면을 덮을 파라필름 조각을 내려 놓고 거품이 남지 않도록하십시오. 필요한 경우 과도한 에탄올을 제거하십시오.각 분기 유리 슬라이드마다 EG3 용액의 40 마이크로 리터 물방울을 습도 챔버의 파라 필름에 추가하여 물방울 사이에 금 슬라이드의 간격을 고려하여 충분한 공간을 남겨 둡니다. 핀셋을 사용하여 C18 프린트된 골드 슬라이드를 물방울 위에 아래로 향하게 배치하여 슬라이드 아래에 거품이 남지 않도록 합니다. 슬라이드를 들어 올리지 않고 부드럽게 밀어 증발을 최소화하십시오.페트리 접시를 파라 필름으로 단단히 밀봉 한 후 적어도 세 시간 동안 실온에서 그대로 두십시오. 생물안전 캐비닛에서 금 슬라이드를 70% 에탄올에 3번 담그고 헹구어 EG3를 제거한 다음 에탄올에 10분간 방치하여 살균합니다. 에탄올을 흡인 후, 멸균 PBS를 첨가한다.시연된 바와 같이 에탄올 대신 PBS로 또 다른 습도 챔버를 준비한다. 다음으로, 각 분기 슬라이드마다 50 마이크로 리터의 피브로넥틴 용액 방울을 파라 필름 상에 첨가하여 물방울 사이에 약간의 공간을 남겨 둡니다. 그런 다음 이전에 설명 된대로 슬라이드를 물방울 위에 아래로 향하게하고 Petri 접시를 생물 안전 캐비닛에 30 분 동안 두십시오.금이 코팅된 슬라이드를 세 번 헹구고 난 후, 슬라이드를 위로 향하게 하여 PBS에 놓는다. 세포를 파종하기 전에 섭씨 37도에서 단련 된 수조에서 배지와 트립신을 따뜻하게하십시오. 더 나은 세포 부착을 위해, 패턴 슬라이드를 배양 배지가 들어있는 12-웰 플레이트에 담그고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 가온하십시오.일단 세포가 트립신화되면, 세포를 FBS 함유 배지로 중화시키고, 세포를 100배 G에서 3분 동안 펠릿 다운한 다음, 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 세포 현탁액을 희석하여 밀리리터 당 200, 000 세포의 농도를 달성하십시오. 0.5 밀리리터의 셀 현탁액을 하나의 골드 슬라이드가 들어있는 각 웰에 첨가하십시오.세포 부착을 위해 15분 동안 인큐베이션하기 전에 균일한 세포 시딩을 위해 플레이트를 몇 번 부드럽게 진탕한다. 15분 후, 현미경으로 세포 부착을 확인하고, 필요하다면, 좀 더 많은 시간 동안 배양한다. 일단 세포가 부착되면, 부착되지 않은 세포를 포함하는 배지를 각 웰에서 흡인하고 한 밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가한다.세포를 24시간 동안 배양기에서 배양하고 컨플루언시를 확인하여 키랄성이 형성되었는지 여부를 결정한다. 필요한 컨플루언시가 달성되면, 배양 배지를 제거하여 세포를 고정시킨다. PBS로 한번 헹구고 난 후, 슬라이드에 4%파라포름알데히드 용액을 첨가하고, PBS로 다시 세 번 헹구기 전에 15분 동안 실온에서 인큐베이션한다.이미지를 획득하려면 카메라 기능이 있는 위상차 현미경을 사용하고 슬라이드의 각 링을 고해상도로 캡처합니다. 키랄성 특성화를 위해 MATLAB 코드 파일을 다운로드하고 코드 폴더와 하위 폴더를 MATLAB 경로에 추가한 다음 ROI_selection을 엽니다. m 파일.네 번째 줄에서 디렉터리를 원하는 데이터 폴더로 변경합니다. 라인 14의 이미지 크기를 처음 두 그림은 링의 내부 원 크기를 나타내고 다른 두 개는 바깥쪽을 나타내는 것으로 변경합니다. 위상차 이미지에서 관심 영역 또는 ROI를 확인하려면 MATLAB 코드 ROI_selection을 실행합니다.m 실행 버튼을 클릭하여. 수동으로 선택 사각형을 드래그하여 링에 맞게 한 다음 이미지를 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다. 폴더의 모든 이미지에서 ROI를 선택하면 각 이미지에 대한 ROI 정보를 저장하기 위해 매트 파일이 생성됩니다.그런 다음 analysis_batch를 엽니 다. m 파일을 만들고 이전에 설명 된대로 폴더의 디렉토리를 변경하십시오. 실행 버튼을 클릭하여 코드를 analysis_batch 실행합니다.m은 다중 세포 고리 패턴의 키랄성을 결정한다. 데이터토엑셀. txt 파일은 각 링에 대한 원형 통계뿐만 아니라 시계 방향이 아닌 키랄 및 반 시계 방향 링의 수를 포함하여 생성됩니다.현재의 발견은 실험적으로 개발 된 고리 패턴 키랄성 분석의 유용성뿐만 아니라 세포 골격의 변화에 대한이 분석의 민감도를 입증합니다. 본 연구에서, 50 나노몰 라트룬쿨린 A 처리로 액틴 중합을 파쇄함으로써, 마우스 근원세포 C2C12 세포가 시계 반대 방향 또는 CCW 키랄 바이어스의 변화를 시계 방향 또는 CW.In 으로 변화시켰음을 발견하였고, 또한 인간 탯줄 혈관 내피 세포 또는 단백질 키나아제 C를 활성화시키기 위해 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate 또는 TPA로 처리한 hUVECs는 CW에서 CCW로의 세포 키랄성의 용량 의존적 이동을 나타내었다. 패턴에 세포를 시딩한 후, 화학물질 또는 약물은 반응을 연구하기 위해 배지에 보충될 수 있고, 트랜스웰 시스템은 세포 공동 배양을 연구하기 위해 혼입될 수 있다.이 분석은 다양한 실험 환경에서 다세포 키랄성을 조사하기위한 효율적인 도구를 제공하여 다양한 생물학적 현상 및 과정에서 세포 키랄성의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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연구

생체공학

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Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...