Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (OD/NICHD DP2HD083961 e NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan é um Estudioso de Ciências Biomédicas (PEW 00026185), apoiado pela Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang é apoiado pela American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).

1. Fabricação de selos de polidimetilsiloxano (PDMS)16
<ol><li>Desenhe uma matriz de anéis de microescala usando o software CAD, com um diâmetro interno de 250 μm e um diâmetro externo de 450 μm. O padrão usado neste protocolo é uma matriz 10 x 10 com uma distância de 850 μm entre os anéis.</li>
	<li>Imprima uma máscara de transparência do padrão na resolução desejada usando o serviço de impressão de máscaras de uma empresa de microfabização (ver Tabela de Materiais...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

O ensaio de padronização em forma de anel descrito aqui fornece uma ferramenta fácil de usar para caracterização quantitativa da quiralidade multicelular, capaz de produzir resultados altamente confiáveis e repetíveis. A geração rápida de microambientes definidos idênticos e análises imparcial permite o processamento automatizado de alto rendimento de grandes tamanhos de amostras. Este protocolo discute a fabricação dos micropatterns do anel, padronização celular e análise automática do alinhamento celu...

A assimetria esquerda-direita (LR) da célula, também conhecida como mão celular ou quiralidade, descreve a polaridade celular no eixo LR e é reconhecida como uma propriedade fundamental, conservada, biofísica 1,2,3,4,5. A quiralidade celular tem sido observada tanto in vivo quanto in vitro em múltiplas escalas. Achados anteriores revelaram o redemoinho quiral de citesqueleto de actina em células únicas semeadas em ilhas circulares6, migração tendenciosa e alinhamento de células dentro dos limites confinados 7,8,9,10,11, e looping assimétrico do tubo de calor de frango 12.
No nível multicelular, a quiralidade celular pode ser determinada a partir da migração ou alinhamento direcional, rotação celular, dinâmica citoesqueletal e posicionamento de organela celular 7,8,9,10,11,12,13. Estabelecemos um ensaio baseado em micropatterning14 para caracterizar eficientemente o viés quiral das células aderentes 7,8,9,10. Com os micropatterns em forma de anel geometricamente confinando aglomerados celulares, as células exibem coletivamente migração direcional e alinhamento tendencioso. Um programa MATLAB foi desenvolvido para detectar e medir automaticamente o alinhamento celular em imagens de contraste de fase do anel. A direção do alinhamento celular local é quantificada com um ângulo tendencioso, dependendo de seu desvio da direção circunferencial. Após a análise estatística, o padrão do anel das células é designado como vieses no sentido anti-horário (CCW) ou no sentido horário (CW).
Este ensaio tem sido usado para caracterizar a quiralidade de fenótipos de células múltiplas (Tabela 1), e a assimetria LR das células tem sido encontrada como fenótipo específico 7,11,15. Além disso, a interrupção da dinâmica da actina e da morfologia pode resultar em uma reversão do viés quiral 7,8, e o estresse oxidativo pode alterar a quiralidade celular também9. Devido à simplicidade do procedimento e à robustez da abordagem 7,8,9,10, este ensaio de quiralidade 2D fornece uma ferramenta eficiente e confiável para determinar e estudar a quiralidade multicelular in vitro.
O objetivo deste protocolo é demonstrar o uso deste método para caracterizar a quiralidade celular. Este protocolo descreve como fabricar matrizes celulares padronizadas através da técnica de impressão de microcontatos e realizar análises de quiralidade de forma automatizada usando o programa MATLAB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

A quiralidade é uma propriedade celular intrínseca, que retrata a assimetria em termos de polarização ao longo do eixo esquerda-direita da célula. Como essa propriedade única atrai cada vez mais atenção devido aos seus importantes papéis no desenvolvimento e na doença, um método padronizado de quantificação para caracterizar a quiralidade celular avançaria na pesquisa e em aplicações potenciais. Neste protocolo, descrevemos um ensaio de caracterização de quiralidade multicelular que utiliza matrizes micropattered de células. Micropatterns celulares são fabricados em lâminas de vidro revestidas de titânio/ouro por impressão de microcontatos. Após a semeadura na direção geométrica definida (por exemplo, em forma de anel), ilhas revestidas de proteínas, as células migram direcionalmente e formam um alinhamento tendencioso em direção ao sentido horário ou ao sentido anti-horário, que pode ser automaticamente analisado e quantificado por um programa MATLAB escrito sob medida. Aqui descrevemos em detalhes a fabricação de substratos micropatterados, semeadura celular, coleta de imagens e análise de dados e mostramos resultados representativos obtidos usando as células NIH/3T3. Este protocolo já foi validado anteriormente em vários estudos publicados e é uma ferramenta eficiente e confiável para estudar a quiralidade celular in vitro.

Quinze minutos após a semeadura das células NIH/3T3, a adesão celular no padrão do anel foi confirmada visualmente por imagens de contraste de fase. Após a cultura subsequente de 24 h, as células nos padrões tornaram-se confluentes e alongadas com alinhamentos claramente assimétricos, tendenciosos em direção à direção do sentido horário (Figura 2). A migração direcional de células anexadas é registrada por imagens de lapso de tempo, motilidade celular e morfogênese podem s...

Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

Apresentamos um protocolo para determinar a quiralidade multicelular in vitro, utilizando a técnica de micropatterning. Este ensaio permite quantificação automática dos vieses esquerdo-direito de vários tipos de células e pode ser usado para fins de triagem.

Um ensaio de micropatterning para medir a quiralidade celular

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

O ensaio de quiralidade celular bast micropatterning é uma ferramenta poderosa para estudar morfogense quiral multicelular no desenvolvimento da doença. Também é importante para a pesquisa celular. Este sistema de macropattern é fácil de fabricar e usar, é capaz de produzir resultados altamente confiáveis e repetíveis, e também é compatível com processamento automatizado de alto rendimento para grande tamanho amostral.Comece cortando o slide revestido de ouro de titânio em pequenos pedaços quadrados de aproximadamente 12 por 12 milímetros. Usando um cortador de vidro, deslize pela superfície para deixar uma faixa amassada, em seguida, segure o deslizamento de vidro em ambos os lados e dobre no amassado para quebrar em pequenos quartos. Para limpar o slide, mergulhe-o com o lado dourado para cima em 100% etanol contido em uma placa de Petri em um shaker orbital por pelo menos 10 minutos.Depois de aspirar o etanol, seque o deslizamento soprando com um fluxo de nitrogênio. Limpe os selos de polidimotilatilatilato ou PDMS com água com sabão antes de secar o carimbo com gás nitrogênio. Dissolva 5,74 miligramas de octadecanethiol ou C18 em 10 mililitros de 100% de etanol para fazer duas soluçãos milimolares C18, depois limpe os selos PDMS com 100% de etanol.Mergulhe o carimbo PDMS com a superfície padrão virada para baixo na solução C18 por 10 segundos e, em seguida, seque-o suavemente com gás nitrogênio por 60 segundos. Uma vez seco, coloque o carimbo virado para baixo no slide de ouro por 60 segundos antes da remoção. Para garantir a correta estampagem, bata suavemente na pinça no selo para transferir corretamente os padrões.Em seguida, prepare as câmaras de umidade, canalizar um mililitro de 70% de etanol em uma tampa de placa de Petri invertida. E usando a pinça, deite um pedaço de parafilme para cobrir a superfície garantindo que não haja bolhas. Remova o excesso de etanol, se necessário.Adicione 40 gotículas de microliter da solução EG3 para cada quarto de deslizamento de vidro no parafilme na câmara de umidade, deixando espaço suficiente entre as gotículas para explicar o espaçamento dos slides de ouro. Use pinças para colocar o slide de ouro impresso C18 voltado para baixo na gotícula, garantindo que não permaneçam bolhas sob o slide. Empurre suavemente os slides juntos sem levantá-los para minimizar a evaporação.Depois de selar a placa de Petri firmemente com parafilm, deixe-a em temperatura ambiente por pelo menos três horas. Em um armário de biossegurança, mergulhe e enxágue o slide de ouro voltado três vezes em 70% de etanol para remover o EG3, depois deixe no etanol por 10 minutos para esterilização. Depois de aspirar o etanol, adicione PBS estéril.Prepare outra câmara de umidade com PBS em vez de etanol como demonstrado. Em seguida, adicione 50 gotículas de microliter de solução de fibronectina para cada quarto deslizar para o parafilme, deixando algum espaço entre gotículas. Em seguida, coloque o slide voltado para baixo na gota como demonstrado anteriormente e deixe a placa de Petri no armário de biossegurança por 30 minutos.Depois de enxaguar o slide revestido de ouro três vezes, coloque o slide voltado para cima no PBS. Antes de semear as células, aqueça a mídia e experimente em um banho de água temperado a 37 graus Celsius. Para melhor fixação celular, mergulhe o slide padrão em uma placa de 12 poços contendo mídia cultural e aqueça-o a 37 graus Celsius na incubadora.Uma vez que as células são experimentadas, neutralize as células com FBS contendo mídia, pelota para baixo as células a 100 vezes G por três minutos e, em seguida, resuspenque a pelota de célula em mídia fresca. Conte as células e dilua a suspensão celular para alcançar a concentração de 200.000 células por mililitro. Adicione 0,5 mililitros da suspensão celular a cada poço contendo um slide de ouro.Agite suavemente a placa algumas vezes para semeadura uniforme da célula antes de incubar por 15 minutos para fixação celular. Após 15 minutos, verifique o acessório da célula sob um microscópio e, se necessário, incubar por mais algum tempo. Uma vez que as células estejam anexadas, aspire a mídia contendo células não ligadas de cada poço e adicione um mililitro de novas mídias culturais.Cultume as células na incubadora por 24 horas e verifique a confluência para determinar se a quiralidade se formou. Quando a confluência necessária for alcançada, fixe as células removendo a mídia cultural. Depois de enxaguar com PBS uma vez, adicione 4% de solução de paraformaldeído ao slide e incuba a temperatura ambiente por 15 minutos antes de enxaguar novamente com PBS três vezes.Para adquirir as imagens, use um microscópio de contraste de fase com a funcionalidade da câmera e capture cada anel no slide em alta resolução. Para caracterização de quiralidade, baixe os arquivos de código MATLAB, adicione a pasta de código e subpastas ao caminho MATLAB e abra o ROI_selection. arquivo m.Na linha quatro, altere o diretório para a pasta de dados desejada. Altere o tamanho da imagem na linha 14 com as duas primeiras figuras representando o tamanho do círculo interno do anel, enquanto as outras duas representam o exterior. Para determinar a região de interesse ou ROI nas imagens de contraste de fase, execute o código MATLAB ROI_selection.m clicando no botão executar. Arraste manualmente o quadrado de seleção para encaixar o anel e clique duas vezes na imagem para confirmar a seleção. Depois de selecionar o ROI de todas as imagens da pasta, um arquivo de tapete será gerado para armazenar as informações do ROI para cada imagem.Então abra o analysis_batch. m arquivar e alterar o diretório da pasta como demonstrado anteriormente. Clique no botão executar para executar o código analysis_batch.m para determinar a quiralidade de múltiplos padrões de anéis celulares. Um datatoexcel. o arquivo txt será gerado contendo estatísticas circulares para cada anel, bem como os números de anéis não quiral e anti-horário no sentido horário.Os achados atuais demonstram a utilidade do ensaio de quiralidade do padrão do anel desenvolvido experimentalmente, bem como a sensibilidade deste ensaio a alterações no citoesqueleto. No presente estudo, verificou-se que, ao interromper a polimerização de actina com tratamento de latrunculina de 50 nanomolar A, as células myoblast C2C12 do camundongo apresentaram uma alteração do viés quiral no sentido anti-horário ou CCW no sentido horário ou CW.In adição, as células endoteliais vasculares umbilicais humanas ou hUVECs que foram tratadas com 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetato ou TPA para ativar a proteína quinase C exibiu uma mudança dependente de dose da quiralidade celular de CW para CCW. Após a semeadura celular aos padrões, produtos químicos ou medicamentos podem ser complementados ao meio para estudar a resposta, e o sistema transwell pode ser incorporado para estudar a co-cultura celular.Este ensaio fornece uma ferramenta eficiente para investigar a quiralidade multicelular em diferentes configurações experimentais que oferece insights importantes sobre o papel da quiralidade celular em vários fenômenos e processos biológicos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Forma Polímeros Memória da Cultura célula ativa

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Bioengenharia

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjeção Ferida Ensaio e<em&gt; In vivo</em&gt; Localização de Epidermal Wound resposta Jornalistas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...