Name: a micropatterning assay for measuring cell chirality
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (OD / NICHD DP2HD083961 ve NHBLI R01HL148104) tarafından finanse edilmiştir. Leo Q. Wan, Pew Charitable Trusts tarafından desteklenen Biyomedikal Bilimler alanında (PEW 00026185) bir Pew Scholar'dır. Haokang Zhang, Amerikan Kalp Derneği Doktora Öncesi Bursu (20PRE35210243) tarafından desteklenmektedir.

1. Polidimetilsiloksan (PDMS) pullarının imalatı16
<ol><li>CAD yazılımını kullanarak, iç çapı 250 μm ve dış çapı 450 μm olan bir dizi mikro ölçekli halka çizin. Bu protokolde kullanılan desen, halkalar arasında 850 μm mesafeye sahip 10 x 10 dizidir.</li>
	<li>Bir mikrofabrikasyon şirketinin maske baskı hizmetini kullanarak desenin saydamlık maskesini istenen çözünürlükte yazdırın (bkz. NOT: Halkanın sağlanan boyutlarının birçok hücre tipi...

<ol>
	<li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture.">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).</li><li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease.">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li><li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality:+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development.">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).</li><li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+broken+left-right+symmetry:+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis.">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505 (2019).</li><li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+neuronal+motility:+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry.">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102 (2019).</li><li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton.">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry.">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li><li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability.">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).</li><li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress.">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li><li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alzheimer's+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells.">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li><li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics.">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li><li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping.">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li><li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality.">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias.">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li><li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation.">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li><li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021)</li><li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation.">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li><li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation.">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).</li></ol>

Burada açıklanan halka şeklindeki modelleme testi, çok hücreli kiralitenin kantitatif karakterizasyonu için kullanımı kolay, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilen bir araç sağlar. Aynı tanımlanmış mikro ortamların hızlı bir şekilde oluşturulması ve tarafsız analiz, büyük boyutlu numunelerin otomatik olarak yüksek verimli bir şekilde işlenmesini sağlar. Bu protokol, halka mikro desenlerinin üretimini, hücre desenini ve önyargılı hücre hizalamasının ve yönlü har...

Hücrenin sol-sağ (LR) asimetrisi, hücresel elverişlilik veya kiralite olarak da bilinir, LR eksenindeki hücre polaritesini tanımlar ve temel, korunmuş, biyofiziksel bir özellik olarak kabul edilir 1,2,3,4,5. Hücre kiralitesi hem in vivo hem de in vitro olarak çoklu ölçeklerde gözlenmiştir. Önceki bulgular, dairesel adalar 6'ya ekilen tek hücrelerde aktin sitoiskeletinin kiral dönüşünü, 7,8,9,10,11 sınırlı sınırlar içindeki hücrelerin önyargılı göçünü ve hizalanmasını ve tavuk ısı tüpünün asimetrik döngüsünü 12 ortaya koymuştur.
Çok hücreli düzeyde, hücre kiralitesi yönlü migrasyon veya hizalama, hücresel rotasyon, sitoiskelet dinamikleri ve hücre organeli konumlandırma 7,8,9,10,11,12,13 ile belirlenebilir. 7,8,9,10 yapışkan hücrelerin kiral yanlılığını etkili bir şekilde karakterize etmek için mikrosendikleme tabanlı 14 tahlil oluşturduk. Halka şeklindeki mikro desenlerin geometrik olarak hücre kümelerini sınırlamasıyla, hücreler toplu olarak yönlü göç ve önyargılı hizalama sergiler. Halkanın faz-kontrast görüntülerindeki hücre hizalamasını otomatik olarak tespit etmek ve ölçmek için bir MATLAB programı geliştirilmiştir. Yerel hücre hizalamasının yönü, çevresel yönden sapmasına bağlı olarak önyargılı bir açı ile ölçülür. İstatistiksel analizi takiben, hücrelerin halka paterni saat yönünün tersine (CCW) önyargılar veya saat yönünde (CW) önyargılar olarak belirlenir.
Bu tahlil, çoklu hücre fenotiplerinin kiralitesini karakterize etmek için kullanılmıştır (Tablo 1) ve hücrelerin LR asimetrisinin fenotipe özgü 7,11,15 olduğu bulunmuştur. Ayrıca, aktin dinamikleri ve morfolojisindeki bozulma, kiral önyargı 7,8'in tersine dönmesine neden olabilir ve oksidatif stres hücre kiralitesini de değiştirebilir9. Prosedürün basitliği ve 7,8,9,10 yaklaşımının sağlamlığı nedeniyle, bu 2D kiralite testi, in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek ve incelemek için etkili ve güvenilir bir araç sağlar.
Bu protokolün amacı, hücre kiralitesini karakterize etmek için bu yöntemin kullanımını göstermektir. Bu protokol, mikrokontakt baskı tekniği ile desenli hücresel dizilerin nasıl üretileceğini ve MATLAB programını kullanarak otomatik bir şekilde kiralite analizinin nasıl yapılacağını açıklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>DSP-MD-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZX microscope system</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temscal</td>
			<td>BJD-1800</td>
			<td>Gold-titanum film coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10024-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tweezers</td>
			<td>Exelta</td>
			<td>390BSAPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>AU18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB_R2020b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAI contact aligner</td>
			<td>OAI</td>
			<td>200</td>
			<td>UV photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octadecanethiol (C18)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O1858-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Research product international</td>
			<td>P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>ID#809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y311075 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium evaporation pellets</td>
			<td>International Advanced Materials</td>
			<td>TI14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparency mask (with feature)</td>
			<td>Outputicity.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mask printing service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a micropatterning assay for measuring cell chirality

Kiralite, asimetriyi hücrenin sol-sağ ekseni boyunca polarizasyon açısından gösteren içsel bir hücresel özelliktir. Bu eşsiz özellik, hem gelişim hem de hastalıktaki önemli rolleri nedeniyle artan bir dikkat çektiğinden, hücre kiralitesini karakterize etmek için standartlaştırılmış bir niceleme yöntemi, araştırmayı ve potansiyel uygulamaları ilerletecektir. Bu protokolde, mikrodesenli hücre dizilerini kullanan çok hücreli bir kiralite karakterizasyon testini tanımlıyoruz. Hücresel mikro desenler, mikrokontakt baskı yoluyla titanyum / altın kaplı cam slaytlar üzerinde üretilir. Geometrik olarak tanımlanmış (örneğin, halka şeklinde), protein kaplı adalarda tohumlamadan sonra, hücreler yönlü olarak göç eder ve özel olarak yazılmış bir MATLAB programı tarafından otomatik olarak analiz edilebilen ve ölçülebilen saat yönünde veya saat yönünün tersine doğru önyargılı bir hizalama oluşturur. Burada mikro desenli substratların üretimini, hücre tohumlamasını, görüntü toplamayı ve veri analizini ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve NIH / 3T3 hücreleri kullanılarak elde edilen temsili sonuçları gösteriyoruz. Bu protokol daha önce yayınlanmış birçok çalışmada doğrulanmıştır ve in vitro hücre kiralitesini incelemek için etkili ve güvenilir bir araçtır.

NIH / 3T3 hücrelerinin tohumlanmasından on beş dakika sonra, halka paternindeki hücre yapışması, faz kontrastlı görüntüleme ile görsel olarak doğrulandı. Daha sonra 24 saatlik kültürden sonra, desenler üzerindeki hücreler birleşti ve saat yönüne doğru önyargılı, açıkça asimetrik hizalamalarla uzadı (Şekil 2). Bağlı hücrelerin yönlü göçü hızlandırılmış görüntüleme ile kaydedilir, hücre hareketliliği ve morfogenezi videonun daha ileri analizleriy...

Watch this Scientific Journal Video about A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality at JoVE.com

A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

Mikrodesenleme tekniğini kullanarak in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, çeşitli hücre tiplerinin sol-sağ önyargılarının otomatik olarak ölçülmesine izin verir ve tarama amacıyla kullanılabilir.

Hücre Kiralitesini Ölçmek için Bir Mikrodesenleme Testi

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

Mikrodesenleyici bast hücre kiralite testi, hastalığın gelişiminde çok hücreli kiral morfogenezi incelemek için güçlü bir araçtır. Hücre araştırmaları için de önemlidir. Bu makromodel sisteminin üretimi ve kullanımı kolaydır, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilir ve ayrıca büyük numune boyutu için otomatik yüksek verimli işleme ile uyumludur.Titanyum altın kaplı slaytı yaklaşık 12 x 12 milimetrelik küçük kare parçalara bölerek başlayın. Bir cam kesici kullanarak, ezilmiş bir iz bırakmak için yüzey boyunca kaydırın, ardından cam slaytı her iki tarafta tutun ve küçük mahallelere ayrılmak için göçükte bükün. Slaytı temizlemek için, altın tarafıyla, yörüngesel bir çalkalayıcıdaki Petri kabında bulunan% 100 etanol içinde en az 10 dakika bekletin.Etanol aspire edildikten sonra, bir azot akımı ile üfleyerek slaytı kurulayın. Damgayı azot gazı ile kurutmadan önce polidimetilsiloksan veya PDMS damgalarını sabunlu suyla temizleyin. İki milimolar C18 çözeltisi yapmak için 5.74 miligram oktadecanethiol veya C18'i 10 mililitre 100% etanol içinde çözün, ardından PDMS damgalarını% 100 etanol ile temizleyin.PDMS damgasını, desen yüzeyi aşağı bakacak şekilde C18 çözeltisinde 10 saniye bekletin ve ardından 60 saniye boyunca azot gazı ile hafifçe kurulayın. Kuruduktan sonra, pulu çıkarmadan önce 60 saniye boyunca altın slaytın üzerine bakacak şekilde yerleştirin. Doğru damgalamayı sağlamak için, desenleri düzgün bir şekilde aktarmak üzere cımbızı yavaşça damganın üzerine dokunun.Daha sonra, bir mililitre% 70 etanol'ü ters çevrilmiş bir Petri kabı kapağına pipetleyerek nem odalarını hazırlayın. Cımbızları kullanarak, yüzeyi örtmek için bir parça parafilm yerleştirin ve kabarcıkların kalmamasını sağlayın. Gerekirse fazla etanol çıkarın.Nem odasındaki parafilm üzerine her çeyrek cam slayt için 40 mikrolitre EG3 çözeltisi damlacıkları ekleyin ve damlacıklar arasında altın slaytların aralığını hesaba katmak için yeterli boşluk bırakın. C18 baskılı altın slaytı damlacığın üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirmek için cımbız kullanın ve slaytın altında kabarcık kalmamasını sağlayın. Buharlaşmayı en aza indirmek için kızakları kaldırmadan yavaşça itin.Petri kabını parafilm ile sıkıca kapattıktan sonra, en az üç saat oda sıcaklığında bırakın. Bir biyogüvenlik kabininde, EG3'ü çıkarmak için% 70 etanolde üç kez yukarı bakan altın sürgüyü ıslatın ve durulayın, ardından sterilizasyon için 10 dakika etanol içinde bırakın. Etanol aspire edildikten sonra steril PBS ekleyin.Gösterildiği gibi etanol yerine PBS ile başka bir nem odası hazırlayın. Daha sonra, parafilm üzerine her çeyrek slayt için 50 mikrolitre fibronektin çözeltisi damlacığı ekleyin ve damlacıklar arasında biraz boşluk bırakın. Ardından, slaytı daha önce gösterildiği gibi damlacığın üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve Petri kabını biyogüvenlik kabininde 30 dakika bekletin.Altın kaplı slaytı üç kez duruladıktan sonra, slaytı PBS'de yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Hücreleri tohumlamadan önce, ortamı ve tripsini 37 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosunda ısıtın. Daha iyi hücre bağlantısı için, desen slaytını kültür ortamı içeren 12 delikli bir plakaya batırın ve inkübatörde 37 santigrat derecede ısıtın.Hücreler tripsinize edildikten sonra, hücreleri FBS içeren medya ile nötralize edin, hücreleri üç dakika boyunca 100 kez G'de pelet edin ve daha sonra hücre peletini taze ortamda yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve mililitre başına 200.000 hücre konsantrasyonunu elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin. Bir altın slayt içeren her bir kuyucuğa 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Hücre bağlantısı için 15 dakika kuluçkaya yatmadan önce düzgün hücre tohumlaması için plakayı birkaç kez hafifçe sallayın. 15 dakika sonra, hücre ekini mikroskop altında kontrol edin ve gerekirse biraz daha kuluçkaya yatırın. Hücreler bağlandıktan sonra, her bir kuyucuktan bağlanmamış hücreler içeren ortamı aspire edin ve bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin.İnkübatördeki hücreleri 24 saat boyunca kültürleyin ve kiralitenin oluşup oluşmadığını belirlemek için akıcılığı kontrol edin. Gerekli akıcılık sağlandığında, kültür ortamını çıkararak hücreleri sabitleyin. PBS ile bir kez duruladıktan sonra, slayta% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve PBS ile üç kez tekrar durulamadan önce oda sıcaklığını 15 dakika inkübe edin.Görüntüleri elde etmek için, kamera işlevselliğine sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanın ve slayttaki her halkayı yüksek çözünürlükte yakalayın. Kiralite karakterizasyonu için MATLAB kod dosyalarını indirin, kod klasörünü ve alt klasörleri MATLAB yoluna ekleyin ve ROI_selection açın. m dosyası.Dördüncü satırda, dizini istediğiniz veri klasörüne değiştirin. 14. satırdaki görüntü boyutunu, halkanın iç daire boyutunu temsil eden ilk iki rakamla değiştirin, diğer ikisi ise dışını temsil eder. Faz kontrast görüntülerindeki ilgi alanını veya yatırım getirisini belirlemek için, ROI_selection MATLAB kodunu yürütün.m çalıştır düğmesine tıklayarak. Halkaya sığması için seçim karesini manuel olarak sürükleyin, ardından seçimi onaylamak için resme çift tıklayın. Klasördeki tüm görüntülerden YG'yi seçtikten sonra, her görüntü için YG bilgilerini depolamak üzere bir paspas dosyası oluşturulur.Ardından analysis_batch açın. m dosyasını açın ve daha önce gösterildiği gibi klasörün dizinini değiştirin. Kod analysis_batch yürütmek için çalıştır düğmesine tıklayın.m, çoklu hücresel halka modellerinin kiralitesini belirlemek için. Bir datatoexcel. txt dosyası, her halka için dairesel istatistiklerin yanı sıra saat yönünde kiral olmayan ve saat yönünün tersine halkaların sayılarını içeren bir dosya oluşturulacaktır.Mevcut bulgular, geliştirilen halka paterni kiralite testinin deneysel olarak yararlılığını ve bu testin hücre iskeletindeki değişikliklere duyarlılığını göstermektedir. Bu çalışmada, 50 nanomolar latrunkülin A tedavisi ile aktin polimerizasyonunu bozarak, fare miyoblastı C2C12 hücrelerinin, saat yönünde veya CCW kiral önyargısının saat yönünde veya CW.In ilavesine bir değişiklik sergilediği, insan göbek vasküler endotel hücrelerinin veya protein kinaz C'yi aktive etmek için 12-o-tetradekanoyl-phorbol-13-asetat veya TPA ile tedavi edilen hUVEC'lerin, hücre kiralitesinin CW'den CCW'ye doza bağlı bir kaydığını gösterdiği bulunmuştur. Kalıplara hücre tohumlamasından sonra, yanıtı incelemek için ortama kimyasallar veya ilaçlar eklenebilir ve transwell sistemi hücre ortak kültürünü incelemek için dahil edilebilir.Bu tahlil, farklı deneysel ortamlar altında çok hücreli kiraliteyi araştırmak için etkili bir araç sağlar, hücre kiralitesinin çeşitli biyolojik fenomen ve süreçlerdeki rolü hakkında önemli bilgiler sunar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Aktif Hücre Kültürü Şekil Bellek Polimerler

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...