Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

نشكر حديقة Hyesuk على المساعدة الفنية. تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 2DK083283 ، إلى NJT) ، والمعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1R01AG060726 ، إلى NJT). نحن نقدر بامتنان جون مولهولاند وكيتي لي من مرفق تصوير علوم الخلية في مركز بيكمان للمساعدة الفنية في التصوير المجهري ثنائي الفوتون.

يتم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للإجراءات التجريبية المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUCs) بجامعة ستانفورد ومستشفى شؤون المحاربين القدامى في بالو ألتو. تم تغذية ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 6-8 أسابيع إما بالطعام أو نظام غذائي للوجبات السريعة مكمل ب 4.2٪ ش?...

<ol>
	<li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis:+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future.">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence,+incidence,+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li><li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis.">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li><li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens.">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).</li><li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging.">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li><li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes.">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition.">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83 (2019).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue.">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398 (2016).</li><li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices.">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li><li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+cancer:+A+strained+relationship.">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).</li><li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrix+in+cancer.">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li><li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

يوضح البروتوكول الحالي أن إزالة الخلايا من خلال معدل تدفق منخفض DOC في التروية في الموقع تحافظ على هياكل الكولاجين الليفي الثلاثي الحلزوني والأصلي القابلة للكسر ، مما يوفر منصة موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لالتقاط إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد NASH. على الرغم من إجراء إزالة ال?...

مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) هو أكثر أمراض الكبد شيوعا ، حيث يصيب 20٪ -25٪ من السكان البالغين. يتقدم 25٪ من مرضى NAFLD إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، حيث يزداد خطر الإصابة بتليف الكبد وفشل الكبدوسرطان الخلايا الكبدية 1. في السنوات العشرين المقبلة ، تشير التقديرات إلى أن NASH ستمثل 2 مليون حالة وفاة مرتبطة بالكبد في الولايات المتحدة2. نظرا لعدم وجود علاجات معتمدة ، هناك حاجة ملحة لفك رموز الآليات التي تسبب تليف الكبد لدى مرضى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي وتطوير علاج مستهدف3.
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي بيئة دقيقة ديناميكية ومعقدة تمارس اتصالا ثنائي الاتجاه مع الخلايا لتنظيم توازن الأنسجة4. يتكون ECM للكبد من عناصر هيكلية مثل البروتيوغليكان والكولاجين والفبرونيكتين والإيلاستين والبروتينات غير الهيكلية الأخرى (مثل olfactomedin و thrombospondin) لتوفير الدعم المادي والهيكلي4.
تليف الكبد هو استجابة مزمنة لالتئام الجروح لتلف الكبد من مسببات مختلفة ، بما في ذلك NASH3. ينتج عن خلل في عملية إعادة تشكيل مصفوفة ECM الديناميكية ويتميز بالبروتينات الهيكلية المفرطة في الكبد المصاب4. يعتمد تكوين الألياف على الاتصال الديناميكي بين الخلايا الخلوية بين أنواع الخلايا الكبدية المختلفة. تتمايز الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) ، عند تنشيطها ، إلى خلايا تشبه الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية الليفية العضلية التي تعبر عن Smooth Muscle Alpha 2 وتهاجر وتتكاثر وتوليف بروتينات ECM كإجراء لإغلاق الجرح. HSCs المنشطة هي الخلايا المركزية المنتجة للكولاجين في الكبد1.
الآلية الجزيئية لإعادة تشكيل ECM ، وأنماط التليف ، وعلاقتها بالأحداث الخلوية ليست واضحة. لا تزال هناك حاجة إلى فهم أفضل لهيكل ECM ثلاثي الأبعاد (3D) ، على الرغم من أن تقنيات قياس الطيف الكتلي ساعدت في تحليل تكوين بروتين ECM4. تقليديا ، تم إجراء صبغة ماسون ثلاثية الألوان ، وبقع Picro Sirius Red ، وتصوير الجيل التوافقي الثاني (SHG) على أقسام الكبد الرقيقة ثنائية الأبعاد (2D). يسمى نمط التليف النموذجي ل NASH "سلك الدجاج" ، والذي يمتد إلى المنطقة 3 وهو تليف حول الجيوب الأنفية / حول الخلايا 5,6. ومع ذلك ، كان هناك نقص في الدراسات التي تركز على بنية 3D للكبد الأصلي ، وخاصة تلك التي لا تنطوي على تقسيم الأنسجة. من شأن أساليب التصوير القوية لتحديد أنماط وخصائص التليف من خلال إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد أن يعزز بشكل كبير فهم آليات NASH وتحديد أهداف علاجية جديدة.
لمواجهة هذه التحديات ، تم تحسين بروتوكول سريع وفعال لتصوير ECM للكبد الأصلي عبر إزالة الخلايا7. إزالة الخلايا من الكبد الكامل هو نهج لإزالة المحتوى الخلوي الكبدي مع الحفاظ على شبكة 3D ECM الأصلية من خلال نضح المنظفات. تم تغذية الفئران إما تشاو أو حمية الوجبات السريعة (FFD) لمدة 14 أسبوعا. تم إجراء إزالة الخلايا بعد نضح الوريد البابي في الموقع بمنظف معتدل ومعدلات تدفق منخفضة للحفاظ على هياكل الكولاجين الليفي الحلزوني الثلاثي والأصلي. تم تطبيق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتحليل التغيرات في هياكل الكولاجين في ECM. تم إعادة تشكيل وتحليل صور 3D لهيكل ECM الأصلي في الكبد الطبيعي و NASH. يوفر إجراء إزالة التروية الخلوية في الموقع وتحليل السقالة بواسطة المجهر ثنائي الفوتون منصة عملية وبأسعار معقولة لتصور إعادة تشكيل ECM الديناميكي في الكبد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) هو أكثر أمراض الكبد المزمنة شيوعا في الولايات المتحدة ، حيث يصيب أكثر من 70 مليون أمريكي. يمكن أن يتطور التهاب الكبد الدهني غير الكحولي إلى التليف وفي النهاية إلى تليف الكبد ، وهو عامل خطر كبير لسرطان الخلايا الكبدية. توفر المصفوفة خارج الخلية (ECM) الدعم الهيكلي وتحافظ على توازن الكبد عبر إشارات الخلايا الأمومية. ينتج تليف الكبد عن خلل في عملية إعادة تشكيل ECM الديناميكية ويتميز بالتراكم المفرط للعناصر الهيكلية والتغيرات المرتبطة بها في الجليكوزامينوجليكان. يطلق على نمط التليف النموذجي ل NASH اسم "سلك الدجاج" ، والذي يتكون عادة من تليف المنطقة 3 حول الجيوب الأنفية / حول الخلايا ، بناء على الميزات التي لاحظتها صبغة ماسون ثلاثية الألوان وبقع بيكروسيروس الحمراء. ومع ذلك ، فإن تقنيات التصوير التقليدية القائمة على شرائح الأنسجة الرقيقة ثنائية الأبعاد (2D) لا يمكنها إظهار التغييرات الهيكلية التفصيلية ثلاثية الأبعاد (3D) ECM ، مما يحد من فهم إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد.
قام العمل الحالي بتحسين بروتوكول سريع وفعال لتصوير بنية ECM الأصلية في الكبد عن طريق إزالة الخلايا لمواجهة التحديات المذكورة أعلاه. تم تغذية الفئران إما بحمية تشاو أو الوجبات السريعة لمدة 14 أسبوعا. تم إجراء إزالة الخلايا بعد نضح الوريد البابي في الموقع ، وتم تطبيق تقنيات الفحص المجهري ثنائي الفوتون على الصورة وتحليل التغيرات في ECM الأصلي. تم إعادة تشكيل وتحليل صور 3D للكبد الطبيعي و NASH. قدم إجراء إزالة التروية الخلوية في الموقع وتحليل السقالة بواسطة المجهر ثنائي الفوتون منصة عملية وموثوقة لتصور إعادة تشكيل ECM الديناميكي في الكبد.

تم الكشف عن ألياف الكولاجين مع الجيل التوافقي الثاني والمجهر ثنائي الفوتون. الإشارة هي من هياكل الكولاجين الثلاثي الحلزوني والأصلي القابل للكسر. لم يتم استخدام أجسام مضادة محددة لتحليل الأنواع الفرعية للكولاجين. ومع ذلك ، يمكن إضافة هذا إلى تقنية التصوير.
عندما تتم دراسة أ...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

يعمل البروتوكول الحالي على تحسين طرق التروية / إزالة الخلايا في الكبد في الموقع وطرق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لإنشاء منصة موثوقة لتصور ديناميكيات إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) أثناء التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH).

تصوير 3D لمصفوفة الكبد خارج الخلية في نموذج فأر لالتهاب الكبد الدهني غير الكحولي

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH هو واحد من أهم أمراض الكبد المزمنة في العالم. يمكن أن يتطور إلى التليف وتليف الكبد وفي النهاية سرطان الكبد. دراسة التغيير الديناميكي ل ECM في NASH يمكن أن تساعد على فهم التليف بشكل أفضل.التقليدية للتصوير لا يمكن أن تظهر تغييرات هيكل 3D ECM ، مما يحد من فهم عملية إعادة عرض ECM الديناميكية في تليف الكبد. للبدء ، قم بوزن الماوس قبل الإجراء. بعد تخدير الفأر حلق المنطقة البطنية باستخدام ماكينة قص الشعر وتطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول.ضع الماوس على ظهره وشل حركة الساقين على اللوحة الجراحية بشريط. استخدم مقص Mayo وملقط Adson لعمل شق بطول ثلاثة سنتيمترات بشكل جانبي في أسفل البطن. ثم شق خمسة سنتيمترات عموديا من أسفل البطن إلى عملية الخنجري دون فتح تجويف الصدر.بعد فتح الصفاق ، ضع الأمعاء برفق على يسار الحيوان وارفع الفص الأيمن من الكبد باستخدام قضيب برأس من الحرير الصناعي لفضح الوريد البابي. لقسطرة الوريد البابي ، قم بتحفيز قسطرة وريدية قياس 24 في الطرف البعيد من الوريد البابي. ضع طرف القسطرة قبل أن يتفرع الوريد البابي إلى الفص الكبدي.اسحب الإبرة فورا عندما تدخل القسطرة الوريد. تأكد من وضع القسطرة بشكل صحيح داخل الوريد عن طريق تعطير الكبد باستخدام PBS باستخدام حقنة ملليلتر واحدة عبر القسطرة. استخدم ملقط Dumont الدقيق ، وإبرة Castroviejo الدقيقة ، وخياطة 4-0 لوضع غرزة أسفل تفرع الوريد البابي وغرزة ثانية على بعد سنتيمتر واحد أدناه لتأمين القسطرة.قم بتوصيل القسطرة بأنبوب سيليكون بطول متر واحد وقطر داخلي ثلاثة ملليمترات وقطر خارجي 4.1 ملم باستخدام موصل إغراء. قم بتوصيل أنبوب السيليكون بمضخة تمعجية وخزان يحتوي على ماء منزوع الأيونات. قم بإزالة فقاعات الهواء داخل الأنبوب بعناية وتجنب توليد فقاعات جديدة أثناء التروية.اضبط المضخة التمعجية على خرج تدفق يبلغ 0.2 ملليلتر في الدقيقة. اطلع أولا على الماء منزوع الأيونات لمدة ساعتين وسيتغير لون الكبد من الأحمر إلى الأصفر أثناء التروية. قم بتبديل محلول التروية إلى 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم واستمر طوال الليل وسيصبح الكبد أبيض في نهاية التروية.قم بتبديل محلول التروية إلى ماء منزوع الأيونات و perfuse لمدة ساعتين. استخدم ملقط Dumont الصغير ومقص النوابض الدقيقة لجمع الكبد منزوع الخلايا وغسله بعناية في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. انقل قطعة صغيرة من الكبد منزوع الخلايا إلى شريحة مجهرية وضع الأنسجة في المنتصف.أضف 10 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للتلاشي إلى الأنسجة باستخدام ماصة لتجنب تجفيف الأنسجة. قم بتغطية المنديل بغطاء زجاجي واستخدم قوة صغيرة لتسطيح العينة. ختم حواف زجاج الغطاء بطلاء أظافر عديم اللون وشفاف.ضع قطرة من زيت الغمر أعلى زجاج الغطاء وضع الشريحة على حامل شريحة المجهر. اخفض العدسة الموضوعية للزيت 20X حتى تلامس زيت الغمر. قم بالتبديل إلى القناة البنفسجية ذات الطول الموجي 405 نانومتر.قم بتشغيل الغالق وتركيز العينة. التنقل وتحديد موضع منطقة الاهتمام للتصوير. قم بإيقاف تشغيل الغالق قبل الانتقال إلى التقاط الصور باستخدام ضوء الليزر.لبدء تشغيل ليزر الفوتونين ، قم بالتبديل إلى عنصر تحكم الكمبيوتر وقم بتشغيل ليزر الفوتون أولا. ثم قم بتشغيل وحدة التحكم بالليزر الفوتون والمصراع لضمان أن طاقة الإخراج أعلى من 2.5 واط. تقليل طاقة الليزر لمنع التبريد الفلوري.حدد واضبط أجهزة الكشف عن كل من مضاعفات الصور والهجين لاستيعاب الفلوروفورات المختارة. اختر عمليات الاستحواذ على الصور المتزامنة أو المتسلسلة. اضبط الثقب على أعلى قيمة.اضبط الأطوال الموجية لليزر ، والكسب ، والطاقة ، وتعويض وقت بقاء البكسل ، ومتوسط حجم البكسل ، والتكبير. قم بتمرير وحدة تحكم الكمبيوتر Z وقم بتعيين أبعاد Z. حدد نقطتي البداية والنهاية واختر عدد الصور المعطاة داخل وحدة التخزين.الحصول على الصور. بعد إجراء المجهر الفوتوني ، كشفت ألياف الكولاجين بدون إزالة الخلايا عن صورة منخفضة الدقة لشبكة الكولاجين. في المصفوفة خارج الخلية منزوعة الخلايا ، لوحظت اختلافات واضحة في التشكل والتوزيع المكاني بين كبد حمية الطعام والوجبات السريعة.أظهرت ألياف الكولاجين والفئران في نظام غذائي تشاو شبكة متشابكة ومنظمة تنظيما جيدا ، في حين أظهرت الفئران التي تتبع نظاما غذائيا للوجبات السريعة حزم كولاجين ذات اتصال أقل. يظهر الهيكل ثلاثي الأبعاد لمصفوفة الكبد خارج الخلية أن ألياف الكولاجين في الفئران على حمية تشاو أظهرت شبكة جيدة التنظيم ، ولكن ليس في فئران الوجبات السريعة. لتأكيد جودة الكولاجين الليفي في المصفوفة خارج الخلية المنزوعة الخلايا ، كانت الشرائح ملطخة بالهيماتوكسيلين Eosin وأحمر Picrosirius.يوضح الهيماتوكسيلين والإيوسين أن جميع الخلايا قد أزيلت. في صور تلطيخ Picrosirius الأحمر ، كشفت المصفوفة خارج الخلية من الفئران التي تتغذى على تشاو عن شبكة جيدة التنظيم. وعلى النقيض من ذلك ، أظهرت الفئران على نظام غذائي للوجبات السريعة ألياف الكولاجين أكثر كثافة.قم بإزالة الفقاعة الموجودة داخل الأنبوب بعناية قبل التروية. سوف تسد الفقاعة الوعاء في الكبد وتؤثر على التروية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

تقييم مستو خلية-التقاطب الظواهر في Ciliopathy ماوس المسخ القوقعة

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

الاستراتيجية غشائي أنبوب خلية تشكيل الفحص: مقارنة خارج الخلية مصفوفة وعامل نمو مخفض خارج الخلية مصفوفة

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

إدراج إجراء خزعة الكبد البقاء في الفئران لتقييم القرار غير الكحولية Steatohepatitis (ناش)

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

المورين الدقة قطع شرائح الكبد كنموذج السابق فيفو بيولوجيا الكبد

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

العلاج من تعاطي المخدرات عن طريق القسطرة الوريدية المركزية في نموذج الفأر من Angiotensin II الناجم عن تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني والمراقبة عن طريق الموجات فوق الصوتية 3D

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

التحقيق في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على مرض الكبد الدهني غير الكحولي في نموذج المختبر الناجم عن حمض النخيل

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Delivery of Cardioactive Therapeutics in a Porcine Myocardial Infarction Model

تقديم العلاجات القلبية في نموذج احتشاء عضلة القلب الخنازير

Myocardial infarction is one of the leading causes of death and disability worldwide, and there is an urgent need for novel cardioprotective or ...

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

Enhancing Transplantation Research Through MicroCT Angiography in Murine Models (Video) | JoVE

زرع الكبد التقويمي الناجح في الفئران باستخدام تصوير الأوعية المقطعي المحوسب

Microcomputed tomography (microCT) angiography is an invaluable resource to researchers. New advances in this technology have allowed for high-quality ...