Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

We bedanken Hyesuk Park voor de technische hulp. Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, naar NJT), het National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, naar NJT). We zijn dankbaar voor Jon Mulholland en Kitty Lee van de Cell Sciences Imaging Facility in het Beckman Center voor technische assistentie bij de beeldvorming met twee fotonenmicroscopie.

Dierproeven worden uitgevoerd volgens de experimentele procedures die zijn goedgekeurd door de institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissies (IACUCs) van Stanford University en het Veterans Affairs Hospital in Palo Alto. 6-8 weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen kregen chow of een fastfooddieet aangevuld met 4,2% fructose-glucosestroop (zie tabel met materialen) in drinkwater gedurende 14 weken5. De muizen werden in standaard kooien gehouden bij een 12 uur donker/licht c...

<ol>
	<li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis:+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future.">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence,+incidence,+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li><li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis.">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li><li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens.">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).</li><li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging.">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li><li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes.">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition.">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83 (2019).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue.">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398 (2016).</li><li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices.">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li><li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+cancer:+A+strained+relationship.">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).</li><li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrix+in+cancer.">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li><li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

Het huidige protocol toont aan dat decellularisatie door middel van een lage stroomsnelheid DOC in situ perfusie de frangible triple-helical en native fibrillaire collageenstructuren behoudt, waardoor een betrouwbaar en kosteneffectief platform wordt geboden om dynamische ECM-remodellering in NASH-leverfibrose vast te leggen. Hoewel decellularisatie werd uitgevoerd in normale en fibrotische levers voordat ECM-componenten werden geïdentificeerd of biologische scaffolds voor celkweek werden gegenereerd, is de dyn...

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is de meest voorkomende leverziekte, die 20% -25% van de volwassen bevolking treft. 25% van de NAFLD-patiënten evolueert naar niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), waarbij het risico op cirrose, leverfalen en hepatocellulair carcinoom toeneemt1. In de komende 20 jaar wordt geschat dat NASH verantwoordelijk zal zijn voor 2 miljoen levergerelateerde sterfgevallen in de VS2. Omdat er geen goedgekeurde behandelingen zijn, is er een dringende noodzaak om de mechanismen te ontcijferen die leverfibrose veroorzaken bij NASH-patiënten en een gerichte behandeling te ontwikkelen3.
De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamische, complexe micro-omgeving die bidirectionele communicatie met cellen uitoefent om weefselhomeostase te reguleren4. De lever-ECM is samengesteld uit structurele elementen zoals proteoglycanen, collageen, fibronectine, elastine en andere niet-structurele eiwitten (bijv. Olfactomedine en trombospondine) om fysieke en structurele ondersteuning te bieden4.
Leverfibrose is een chronische wondgenezingsreactie op leverschade van verschillende etiologieën, waaronder NASH3. Het is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-matrixremodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige structurele eiwitten in de gewonde lever4. Fibrogenese is afhankelijk van de dynamische cel-cel communicatie tussen verschillende leverceltypen. Hepatische stellaatcellen (HSC's), wanneer geactiveerd, differentiëren in Smooth Muscle Alpha 2 Actine-expresserende, migrerende en prolifererende myofibroblastachtige cellen en synthetiseren ECM-eiwitten als een wondsluitende actie. Geactiveerde HSC's zijn de centrale collageenproducerende cellen in de lever1.
Het moleculaire mechanisme van ECM-remodellering, patronen van fibrose en hun relatie met cellulaire gebeurtenissen zijn niet duidelijk. Een beter begrip van de driedimensionale (3D) ECM-structuur is nog steeds nodig, hoewel massaspectrometrietechnieken hebben geholpen bij het analyseren van de ECM-eiwitsamenstelling4. Traditioneel zijn Masson's trichrome vlek, Picro Sirius Red vlekken en tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming uitgevoerd op tweedimensionale (2D) dunne leversecties. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt "kippengaas" genoemd, dat zich uitstrekt tot zone 3 en perisinusoïdale / pericellulaire fibrose 5,6 is. Er is echter een gebrek aan studies die zich richten op de 3D-structuur van de inheemse lever, met name die waarbij geen weefselsectie plaatsvindt. Robuuste beeldvormingsbenaderingen om patronen en kenmerken van fibrose te identificeren tijdens dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose zouden het begrip van NASH-mechanismen aanzienlijk versterken en nieuwe therapeutische doelen identificeren.
Om deze uitdagingen aan te gaan, werd een snel en efficiënt protocol geoptimaliseerd om de inheemse lever-ECM in beeld te brengen via decellularisatie7. Decellularisatie van de hele lever is een benadering om de hepatische cellulaire inhoud te verwijderen met behoud van het oorspronkelijke 3D ECM-netwerk door middel van wasmiddelperfusie. Muizen kregen gedurende 14 weken chow of fastfooddieet (FFD). Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ poortaderperfusie met mild reinigingsmiddel en lage stroomsnelheden om triple-spiraalvormige en inheemse fibrillaire collageenstructuren te behouden. Twee-fotonenmicroscopie werd toegepast om veranderingen in collageenstructuren in ECM te analyseren. De 3D-beelden van de oorspronkelijke ECM-structuur in normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusie decellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-foton microscopie biedt een praktisch en betaalbaar platform om de dynamische ECM-remodellering in de lever te visualiseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is de meest voorkomende chronische leverziekte in de Verenigde Staten, die meer dan 70 miljoen Amerikanen treft. NASH kan zich ontwikkelen tot fibrose en uiteindelijk tot cirrose, een belangrijke risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De extracellulaire matrix (ECM) biedt structurele ondersteuning en handhaaft de leverhomeostase via matricellulaire signalen. Leverfibrose is het gevolg van een onbalans in het dynamische ECM-remodelleringsproces en wordt gekenmerkt door overmatige accumulatie van structurele elementen en bijbehorende veranderingen in glycosaminoglycanen. Het typische fibrosepatroon van NASH wordt "kippengaas" genoemd, dat meestal bestaat uit zone 3 perisinusoïdale / pericellulaire fibrose, gebaseerd op kenmerken waargenomen door Masson's trichrome vlek en Picrosirius Red-vlekken. Deze traditionele dunne tweedimensionale (2D) op weefseldia's gebaseerde beeldvormingstechnieken kunnen echter niet de gedetailleerde driedimensionale (3D) ECM-structurele veranderingen aantonen, waardoor het begrip van de dynamische ECM-remodellering bij leverfibrose wordt beperkt.
Het huidige werk optimaliseerde een snel en efficiënt protocol om de oorspronkelijke ECM-structuur in de lever via decellularisatie in beeld te brengen om de bovenstaande uitdagingen aan te pakken. Muizen werden gedurende 14 weken gevoed met chow of fastfooddieet. Decellularisatie werd uitgevoerd na in situ portale aderperfusie en de twee-foton microscopietechnieken werden toegepast om veranderingen in de inheemse ECM in beeld te brengen en te analyseren. De 3D-beelden van de normale en NASH-levers werden gereconstitueerd en geanalyseerd. Het uitvoeren van in situ perfusiedecellularisatie en het analyseren van de steiger door twee-fotonenmicroscopie bood een praktisch en betrouwbaar platform om de dynamische ECM-remodellering in de lever te visualiseren.

De collageenvezels werden gedetecteerd met tweede harmonische generatie en twee-fotonenmicroscopie. Het signaal is afkomstig van de frangible triple-helical en native fibrillaire collageenstructuren. Specifieke antilichamen werden niet gebruikt om collageensubtypen te analyseren; Dit zou echter kunnen worden toegevoegd aan de beeldvormingstechniek.
Wanneer het leverweefsel wordt bestudeerd zonder decellularisatie, is het een uitdaging om beelden met hoge resolutie van het collageennetwerk te k...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Het huidige protocol optimaliseert de lever in situ perfusie / decellularisatie en twee-foton microscopie methoden om een betrouwbaar platform te creëren om de dynamiek van extracellulaire matrix (ECM) remodellering tijdens niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) te visualiseren.

3D-beeldvorming van de extracellulaire levermatrix in een muismodel van niet-alcoholische steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH is een van de belangrijkste chronische leverziekten ter wereld. Het kan zich ontwikkelen tot fibrose, cirrose en uiteindelijk de leverkanker. Het bestuderen van de dynamische verandering van de ECM in de NASH kan helpen om de fibrose beter te begrijpen.Traditionele beeldvorming kan geen 3D ECM-structuurveranderingen aantonen, waardoor het begrip van het dynamische ECM-remodelleringsproces in de leverfibrose wordt beperkt. Weeg om te beginnen de muis vóór de procedure. Na het verdoven van de muis scheer je het ventrale gebied met een tondeuse en desinfecteer je de huid met 70% ethanol.Plaats de muis op zijn rug en immobiliseer de benen op de operatieplaat met tape. Gebruik een Mayo-schaar en een Adson-tang om een incisie van drie centimeter lateraal in de onderbuik te maken. En dan een incisie van vijf centimeter verticaal van de lage buik naar het xiphoid-proces zonder de borstholte te openen.Na het openen van het peritoneum, plaatst u de darmen voorzichtig naar links van het dier en verhoogt u de rechterkwab van de lever met een applicator met rayonpunt om de poortader bloot te leggen. Om de poortader te katheteriseren, induceert u een 24 gauge IV-katheter in het distale uiteinde van de poortader. Plaats de katheterpunt voordat de poortader zich vertakt in de leverkwabben.Trek de naald onmiddellijk terug wanneer de katheter in de ader komt. Controleer of de katheter correct in de ader is geplaatst door de lever te perfuseren met PBS met behulp van een spuit van één milliliter via de katheter. Gebruik Dumont microtang, een Castroviejo micronaald en 4-0 hechtdraad om een steek onder de vertakking van de poortader te plaatsen en een tweede steek een centimeter lager om de katheter vast te zetten.Sluit de katheter aan op een siliconen slang van een meter lengte, drie millimeter binnendiameter en 4,1 millimeter buitendiameter met een lokconnector. Sluit de siliconenslang aan op een peristaltische pomp en een reservoir met gedeïoniseerd water. Verwijder voorzichtig de luchtbellen in de buis en vermijd het genereren van nieuwe bellen tijdens de perfusie.Stel de peristaltische pomp in op een debiet van 0,2 milliliter per minuut. Blader eerst met gedeïoniseerd water gedurende twee uur en de kleur van de lever zal tijdens de perfusie veranderen van rood naar geel. Schakel de perfusieoplossing over op 0,5% natriumdeoxycholaat en ga 's nachts verder en de lever wordt wit aan het einde van de perfusie.Schakel de perfusieoplossing over op gedeïoniseerd water en laat gedurende twee uur doorstromen. Gebruik Dumont microtangen en micros verende scharen om de gedecellulariseerde lever te verzamelen en voorzichtig te wassen in een petrischaaltje met PBS. Breng een klein stukje gedecellulariseerde lever over op een microscoopglaasje en plaats het weefsel in het midden.Voeg 10 microliter antifade montagemedium toe aan het weefsel met een pipet om uitdroging van het weefsel te voorkomen. Bedek de tissue met een dekglas en oefen een kleine kracht uit om het monster plat te maken. Sluit de randen van het afdekglas af met kleurloze en transparante nagellak.Plaats een druppel van een dompelolie op de bovenkant van het afdekglas en plaats de dia op de microscoopglaashouder. Laat de 20X olieobjectieflens zakken totdat deze in contact komt met de dompelolie. Schakel over naar het violette kanaal met een golflengte van 405 nanometer.Zet de sluiter aan en stel het monster scherp. Navigeer en positioneer het interessegebied voor beeldvorming. Schakel de sluiter uit voordat u naar beeldacquisitie gaat met behulp van laserlicht.Om de twee fotonenlaser te starten, schakelt u over naar de computerbesturing en schakelt u eerst de twee fotonenlaser in. Schakel vervolgens de twee fotonenlasercontroller en sluiter in om ervoor te zorgen dat het uitgangsvermogen hoger is dan 2,5 watt. Verminder het laservermogen om fluorescentie-blussen te voorkomen.Selecteer en pas detectoren aan, zowel fotovermenigvuldigers als de hybride, om plaats te bieden aan de gekozen fluoroforen. Kies gelijktijdige of opeenvolgende beeldacquisities. Stel het gaatje in op de hoogste waarde.Pas lasergolflengten, versterking, vermogen, verschuiving van de pixelverblijftijd, pixelgroottemiddeling en zoom aan. Schuif door de Z-controller van de computer en stel de Z-afmetingen in. Definieer het begin- en eindpunt en kies het aantal afbeeldingen dat binnen een volume wordt gegeven.Verkrijg afbeeldingen. Na het uitvoeren van de twee fotonenmicroscopie onthulden collageenvezels zonder decellularisatie een afbeelding met een lage resolutie van het collageennetwerk. In de gedecellulariseerde extracellulaire matrix werden schijnbare verschillen waargenomen in de morfologie en ruimtelijke verdeling tussen chow en fastfooddieetlevers.Collageenvezels en muizen op een chow-dieet vertoonden een verweven en goed georganiseerd netwerk, terwijl de muizen op een fastfooddieet collageenbundels vertoonden met minder connectiviteit. De driedimensionale structuur van de lever extracellulaire matrix laat zien dat de collageenvezels bij muizen op het chow-dieet een goed georganiseerd netwerk vertoonden, maar niet bij fastfooddieetmuizen. Om de kwaliteit van het fibrillaire collageen in de gedecellulariseerde extracellulaire matrix te bevestigen, werden de dia's gekleurd met Hematoxyline Eosin en Picrosirius rood.Hematoxyline en Eosine laten zien dat alle cellen zijn verwijderd. In de Picrosirius-rode kleuringsafbeeldingen onthulde de extracellulaire matrix van de met chow gevoede muizen een goed georganiseerd netwerk. En daarentegen vertoonden muizen op een fastfooddieet dichtere collageenvezels.Verwijder voorzichtig de bubbel in een buis voor de perfusie. De bel blokkeert het vat in de lever en beïnvloedt de perfusie.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

Opneming van een Survivable lever biopsie Procedure bij muizen te beoordelen van de resolutie van de niet-alkoholische Steatohepatitis (NASH)

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Lever Plakjes als een Ex Vivo Model van leverbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

Medicamenteuze behandeling door centrale veneuze katheter in een muismodel van angiotensine II geïnduceerd abdominaal aorta-aneurysma en monitoring door 3D-echografie

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Onderzoek naar de beschermende effecten van Platycodin D op niet-alcoholische leververvetting in een palmitinezuur-geïnduceerd in vitro model

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Delivery of Cardioactive Therapeutics in a Porcine Myocardial Infarction Model

Levering van cardioactieve therapieën in een model voor een myocardinfarct bij varkens

Myocardial infarction is one of the leading causes of death and disability worldwide, and there is an urgent need for novel cardioprotective or ...

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

Enhancing Transplantation Research Through MicroCT Angiography in Murine Models (Video) | JoVE

Succesvolle orthotope levertransplantatie bij muizen met behulp van microcomputertomografie-angiografie

Microcomputed tomography (microCT) angiography is an invaluable resource to researchers. New advances in this technology have allowed for high-quality ...