Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

אנו מודים להיסוק פארק על העזרה הטכנית. מחקר זה נתמך על ידי מימון מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, ל- NJT), המכון הלאומי להזדקנות (NIA), NIH (1R01AG060726, ל- NJT). אנו מודים לג'ון מלהולנד וקיטי לי ממתקן הדימות למדעי התא במרכז בקמן על הסיוע הטכני בהדמיה במיקרוסקופ של שני פוטונים.

ניסויים בבעלי חיים מבוצעים על פי נהלי הניסוי שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUCs) של אוניברסיטת סטנפורד ובית החולים לענייני חיילים משוחררים בפאלו אלטו. עכברים זכרים בני 6-8 שבועות C57BL/6J הוזנו בצ'או או בתזונה של מזון מהיר בתוספת סירופ תירס עתיר פרוקטוז 4.2% (ראו טבל...

<ol>
	<li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis:+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future.">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence,+incidence,+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li><li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis.">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li><li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens.">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).</li><li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging.">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li><li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes.">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition.">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83 (2019).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue.">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398 (2016).</li><li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices.">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li><li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+cancer:+A+strained+relationship.">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).</li><li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrix+in+cancer.">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li><li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מראה כי דה-צלולריזציה באמצעות זילוח DOC באתרו בקצב זרימה נמוך משמרת את מבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי, ומספקת פלטפורמה אמינה וחסכונית ללכידת עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס כבד NASH. למרות שדה-צלולריזציה בוצעה בכבדים רגילים ופיברוטיים לפני זיהוי רכיבי ECM או יצ...

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא מחלת הכבד הנפוצה ביותר, המשפיעה על 20%-25% מהאוכלוסייה הבוגרת. 25% מחולי NAFLD מתקדמים לסטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), שם הסיכון לשחמת, אי ספיקת כבד וקרצינומה הפטוצלולרית עולה1. ב-20 השנים הבאות, ההערכה היא כי NASH יהיה אחראי ל-2 מיליון מקרי מוות הקשורים לכבד בארה"ב2. מכיוון שאין טיפולים מאושרים, יש צורך דחוף לפענח את המנגנונים הגורמים לפיברוזיס בכבד בחולי NASH ולפתח טיפול ממוקד3.
המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מיקרו-סביבה דינמית ומורכבת המפעילה תקשורת דו-כיוונית עם תאים כדי לווסת את הומאוסטזיס רקמות4. ECM הכבד מורכב מאלמנטים מבניים כגון פרוטאוגליקנים, קולגן, פיברונקטין (fibronectin), אלסטין וחלבונים לא מבניים אחרים (למשל, אולפקטומדין וטרומבוספונדין) כדי לספק תמיכה פיזית ומבנית4.
פיברוזיס בכבד היא תגובה כרונית לריפוי פצעים לנזק לכבד של אטיולוגיות שונות, כולל NASH3. היא נובעת מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של מטריצת ECM ומאופיינת בעודף חלבונים מבניים בכבד הפגוע4. פיברוגנזה תלויה בתקשורת התא-תא הדינמית בין סוגים שונים של תאי כבד. תאי סטלט בכבד (HSCs), כאשר הם מופעלים, מתמיינים לתאים דמויי מיופיברובלסטים המבטאים, נודדים ומתרבים של אקטין שריר חלק ומסנתזים חלבוני ECM כפעולה לסגירת פצעים. HSCs פעילים הם התאים המרכזיים מייצרי הקולגן בכבד1.
המנגנון המולקולרי של עיצוב מחדש של ECM, דפוסי פיברוזיס והקשר שלהם לאירועים תאיים אינם ברורים. עדיין נדרשת הבנה טובה יותר של מבנה ה-ECM התלת-ממדי (3D), למרות שטכניקות ספקטרומטריית מסות סייעו לנתח את הרכב החלבונים ECM4. באופן מסורתי, כתם הטריכרום של מאסון, הכתמים האדומים של פיקרו סיריוס והדמיית הדור ההרמוני השני (SHG) בוצעו על קטעי כבד דקים דו-ממדיים (דו-ממדיים). דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט תרנגולת", אשר משתרע לאזור 3 והוא פיברוזיס perisinusoidal/pericellular 5,6. עם זאת, חסרים מחקרים המתמקדים במבנה התלת-ממדי של הכבד הטבעי, במיוחד אלה שאינם כרוכים בחתך רקמות. גישות הדמיה חזקות לזיהוי דפוסים ומאפיינים של פיברוזיס במהלך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד יחזקו באופן משמעותי את ההבנה של מנגנוני NASH ויזהו מטרות טיפוליות חדשות.
כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פרוטוקול מהיר ויעיל הותאם להדמיה של ECM הכבד המקורי באמצעות דה-צלולריזציה7. דה-צלולריזציה של כל הכבד היא גישה להסרת התוכן התאי בכבד תוך שמירה על רשת ECM תלת-ממדית מקורית באמצעות זילוח חומרי ניקוי. עכברים הוזנו בצ'או או בדיאטת מזון מהיר (FFD) במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו עם חומר ניקוי עדין וספיקות נמוכות כדי לשמר מבני קולגן תלת-סליליים ופיברילריים מקומיים. מיקרוסקופ שני פוטונים יושם כדי לנתח שינויים במבני קולגן ב- ECM. התמונות התלת-ממדיות של מבנה ה-ECM המקורי בכבדים רגילים ובכבדי NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום במיקרוסקופ של שני פוטונים מספק פלטפורמה מעשית ובמחיר סביר לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) היא מחלת הכבד הכרונית הנפוצה ביותר בארצות הברית, המשפיעה על יותר מ -70 מיליון אמריקאים. NASH יכול להתקדם לפיברוזיס ובסופו של דבר לשחמת הכבד, גורם סיכון משמעותי לקרצינומה הפטוצלולרית. המטריצה החוץ תאית (ECM) מספקת תמיכה מבנית ושומרת על הומאוסטזיס בכבד באמצעות אותות מטריתיים. פיברוזיס בכבד נובע מחוסר איזון בתהליך העיצוב מחדש הדינמי של ECM ומאופיין בהצטברות יתר של אלמנטים מבניים ושינויים נלווים בגליקוזאמינוגליקנים. דפוס הפיברוזיס הטיפוסי של NASH נקרא "חוט עוף", אשר בדרך כלל מורכב מפיברוזיס perisinusoidal/pericellular zone 3, בהתבסס על תכונות שנצפו על ידי כתם טריכרום של Masson וכתמים אדומים Picrosirius. עם זאת, טכניקות הדמיה מסורתיות דו-ממדיות (2D) מבוססות שקופיות רקמה אינן יכולות להדגים את השינויים המבניים המפורטים של ECM תלת-ממדי (3D), ומגבילים את ההבנה של עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס בכבד.
העבודה הנוכחית אופטימיזציה פרוטוקול מהיר ויעיל כדי לדמות את מבנה ECM המקורי בכבד באמצעות decellularization כדי להתמודד עם האתגרים לעיל. עכברים הוזנו בצ'או או במזון מהיר במשך 14 שבועות. דה-צלולריזציה בוצעה לאחר זילוח ורידים פורטלי באתרו , וטכניקות המיקרוסקופ הדו-פוטוני יושמו כדי לצלם ולנתח שינויים ב-ECM המקורי. התמונות התלת-ממדיות של הכבד הנורמלי והכבד NASH שוחזרו ונותחו. ביצוע דה-צלולריזציה של זילוח באתרו וניתוח הפיגום על ידי מיקרוסקופ של שני פוטונים סיפקו פלטפורמה מעשית ואמינה לדמיין את העיצוב מחדש הדינמי של ECM בכבד.

סיבי הקולגן זוהו באמצעות יצירה הרמונית שנייה ומיקרוסקופ של שני פוטונים. האות מגיע ממבני הקולגן התלת-סלילי והפיברילרי הטבעי. נוגדנים ספציפיים לא שימשו לניתוח תת-סוגים של קולגן; עם זאת, ניתן להוסיף זאת לטכניקת ההדמיה.
כאשר רקמת הכבד נחקרת ללא דה-צלולריזציה, מאתגר לקבל תמונות ?...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

הפרוטוקול הנוכחי מייעל את שיטות זילוח / דה-צלולריזציה באתרו של הכבד ושיטות מיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי ליצור פלטפורמה אמינה להמחשת הדינמיקה של עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במהלך סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH).

הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH היא אחת ממחלות הכבד הכרוניות החשובות ביותר בעולם. זה יכול להתקדם פיברוזיס, שחמת, ובסופו של דבר סרטן הכבד. חקר השינוי הדינמי של ECM ב-NASH יכול לעזור להבין את הפיברוזיס טוב יותר.הדמיה מסורתית אינה יכולה להדגים שינויים במבנה ECM תלת-ממדי, מה שמגביל את ההבנה של תהליך עיצוב מחדש דינמי של ECM בפיברוזיס של הכבד. כדי להתחיל, לשקול את העכבר לפני ההליך. לאחר הרדמה, העכבר לגלח את אזור הגחון באמצעות קוצץ שיער ולחטא את העור עם 70% אתנול.הניחו את העכבר על גבו ושתקו את הרגליים על לוח הניתוחים בעזרת נייר דבק. השתמש במספריים של מאיו ומלקחיים אדסון כדי לבצע חתך של שלושה סנטימטרים לרוחב בבטן התחתונה. ואז חתך של חמישה סנטימטרים אנכית מהבטן התחתונה לתהליך הקסיפואיד מבלי לפתוח את חלל החזה.לאחר פתיחת הצפק, מניחים בעדינות את המעיים משמאל לחיה ומרימים את האונה הימנית של הכבד עם מוליך קצוות קרניים כדי לחשוף את וריד הפורטל. כדי לצנתר את הווריד הפורטלי, יש להכניס צנתר IV בעל מד 24 לקצה הדיסטלי של וריד הפורטל. הניחו את קצה הצנתר לפני שווריד הפורטל מסתעף לאונות הכבד.למשוך את המחט מיד כאשר הצנתר נכנס לווריד. בדוק כי הצנתר ממוקם כראוי בתוך הווריד על ידי ניקוב הכבד עם PBS באמצעות מזרק של מיליליטר אחד דרך הצנתר. השתמש במלקחיים מיקרו של Dumont, מיקרו-מחט Castroviejo ותפר 4-0 כדי להניח תפר מתחת להסתעפות של וריד הפורטל ותפר שני סנטימטר אחד מתחת כדי לאבטח את הצנתר.חברו את הצנתר לצינור סיליקון באורך מטר, בקוטר פנימי של שלושה מילימטר ובקוטר חיצוני של 4.1 מילימטר באמצעות מחבר פיתוי. חברו את צינורות הסיליקון למשאבה פריסטלטית ולמאגר מים שעברו דה-יוניזציה. הסר בזהירות את בועות האוויר בתוך הצינור והימנע מיצירת בועות חדשות במהלך הזילוח.הגדר את המשאבה הפריסטלטית בתפוקת זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה. יש לעיין תחילה במים שעברו דה-יוניזציה במשך שעתיים וצבע הכבד ישתנה מאדום לצהוב במהלך הזילוח. החליפו את תמיסת הזילוח ל-0.5% נתרן דאוקסיכולאט והמשיכו למשך הלילה והכבד יהפוך לבן בסוף הזילוח.החליפו את תמיסת הזילוח למים נטולי יונים, ונתזה למשך שעתיים. השתמשו במלקחיים מיקרו של Dumont ובמספריים של מיקרוס כדי לאסוף את הכבד נטול התאים ולשטוף אותו בזהירות בצלחת פטרי עם PBS. מעבירים חתיכה קטנה של כבד נטול תאים לשקופית מיקרוסקופ ומניחים את הרקמה באמצע.הוסף 10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה לרקמה עם פיפטה כדי למנוע התייבשות רקמות. מכסים את הרקמה בזכוכית כיסוי ומפעילים כוח קטן כדי לשטח את הדגימה. אטמו את שולי זכוכית הכיסוי בלק חסר צבע ושקוף.הניחו טיפה של שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי והניחו את המגלשה על מחזיק המגלשה במיקרוסקופ. מנמיכים את עדשת האובייקט עם שמן 20X עד שהיא באה במגע עם שמן הטבילה. עבור לערוץ הסגול באורך גל 405 ננומטר.הפעל את התריס ומקד את הדגימה. נווט ומקם את תחום העניין להדמיה. כבה את התריס לפני המעבר לרכישת תמונה באמצעות אור לייזר.כדי להפעיל את לייזר שני הפוטון, עבור לבקרת המחשב והפעל תחילה את לייזר שני הפוטון. לאחר מכן הפעל את בקר הלייזר והתריס של שני הפוטון, וודא שהספק היציאה גבוה מ- 2.5 וואט. הפחת את עוצמת הלייזר כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.בחר והתאם גלאים הן מכפילי תמונה והן היברידי כדי להתאים לפלואורופורים שנבחרו. בחר רכישות תמונה בו-זמניות או רציפות. התאם את חור הסיכה לערך הגבוה ביותר.התאם את אורכי הגל של הלייזר, הרווח, העוצמה, קזז את זמן השהייה של הפיקסלים, ממוצע גודל הפיקסלים והזום. גלול בבקר Z של המחשב והגדר את מידות Z. הגדר את נקודות ההתחלה והסיום ובחר את מספר התמונות שניתנו באמצעי אחסון.רכוש תמונות. לאחר ביצוע שני מיקרוסקופיית פוטונים, סיבי קולגן ללא דה-צלולריזציה חשפו תמונה ברזולוציה נמוכה של רשת הקולגן. במטריצה החוץ-תאית הדה-תאית נצפו הבדלים ניכרים במורפולוגיה ובהתפלגות המרחבית בין כבד דיאטת צ'או לכבד דיאטת מזון מהיר.סיבי קולגן ועכברים בדיאטת צ'או הציגו רשת משולבת ומאורגנת היטב, בעוד שהעכברים שקיבלו דיאטת מזון מהיר הראו חבילות קולגן עם פחות קישוריות. המבנה התלת-ממדי של המטריצה החוץ תאית בכבד מראה כי סיבי הקולגן בעכברים שקיבלו דיאטת צ'או הראו רשת מאורגנת היטב, אך לא בעכברי דיאטת מזון מהיר. כדי לאשר את איכות הקולגן הפיברילרי במטריצה החוץ תאית הדה-צלולרית, השקופיות הוכתמו בהמטוקסילין אאוסין ובאדום פיקרוסיריוס (Picrosirius).Hematoxylin ו Eosin להראות כי כל התאים הוסרו. בתמונות הצביעה האדומה של פיקרוסיריוס (Picrosirius), המטריצה החוץ-תאית של העכברים שניזונו מצ'או חשפה רשת מאורגנת היטב. לעומת זאת, עכברים בדיאטת מזון מהיר הראו סיבי קולגן צפופים יותר.בזהירות להסיר את הבועה בתוך צינור לפני זילוח. הבועה תחסום את כלי הדם בכבד ותשפיע על הזלוף.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

התאגדות של הליך ביופסיה בכבד שורדת בעכברים כדי להעריך Steatohepatitis אלכוהוליים (נאש) רזולוציה

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

טיפול תרופתי על ידי קטטר ורידי מרכזי במודל עכבר של אנגיוטנסין II מפרצת אבי העורקים הבטני המושרה וניטור על ידי אולטרסאונד 3D

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

חקירת ההשפעות המגינות של Platycodin D על מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית במודל מבחנה המושרה על ידי חומצה פלמיטית

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Delivery of Cardioactive Therapeutics in a Porcine Myocardial Infarction Model

מתן טיפולים קרדיואקטיביים במודל אוטם שריר הלב חזירי

Myocardial infarction is one of the leading causes of death and disability worldwide, and there is an urgent need for novel cardioprotective or ...

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

Enhancing Transplantation Research Through MicroCT Angiography in Murine Models (Video) | JoVE

השתלת כבד אורתוטופית מוצלחת בעכברים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת אנגיוגרפיה

Microcomputed tomography (microCT) angiography is an invaluable resource to researchers. New advances in this technology have allowed for high-quality ...