Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

Ringraziamo Hyesuk Park per l'aiuto tecnico. Questa ricerca è stata sostenuta dal finanziamento del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Ringraziamo Jon Mulholland e Kitty Lee del Cell Sciences Imaging Facility del Beckman Center per l'assistenza tecnica con l'imaging al microscopio a due fotoni.

Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti secondo le procedure sperimentali approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Stanford University e del Veterans Affairs Hospital di Palo Alto. Topi maschi C57BL / 6J di 6-8 settimane sono stati alimentati con chow o una dieta fast-food integrata con sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio al 4,2% (vedi Tabella dei materiali) in acqua potabile per 14 settimane5. I topi sono stati tenuti...

<ol>
	<li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis:+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future.">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence,+incidence,+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li><li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis.">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li><li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens.">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).</li><li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging.">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li><li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes.">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition.">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83 (2019).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue.">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398 (2016).</li><li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices.">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li><li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+cancer:+A+strained+relationship.">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).</li><li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrix+in+cancer.">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li><li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

Il presente protocollo mostra che la decellularizzazione attraverso una perfusione DOC in situ a bassa portata preserva le strutture frangibili di collagene fibrillare a tripla elica e nativa, fornendo una piattaforma affidabile ed economica per catturare il rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica NASH. Sebbene la decellularizzazione sia stata eseguita in fegati normali e fibrotici prima di identificare i componenti della ECM o generare scaffold biologici per la coltura cellulare, la dinamica del ...

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è la malattia epatica più comune, che colpisce il 20% -25% della popolazione adulta. Il 25% dei pazienti con NAFLD progredisce verso la steatoepatite non alcolica (NASH), dove aumenta il rischio di cirrosi, insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare1. Nei prossimi 20 anni, si stima che la NASH rappresenterà 2 milioni di decessi correlati al fegato negli Stati Uniti2. Poiché non esistono trattamenti approvati, vi è un urgente bisogno di decifrare i meccanismi che causano la fibrosi epatica nei pazienti con NASH e sviluppare un trattamento mirato3.
La matrice extracellulare (ECM) è un microambiente dinamico e complesso che esercita una comunicazione bidirezionale con le cellule per regolare l'omeostasi tissutale4. La ECM epatica è composta da elementi strutturali come proteoglicani, collagene, fibronectina, elastina e altre proteine non strutturali (ad esempio, olfattomadina e trombospondina) per fornire supporto fisico e strutturale4.
La fibrosi epatica è una risposta cronica di guarigione delle ferite al danno epatico di varie eziologie, tra cui la NASH3. Deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della matrice ECM ed è caratterizzato da eccessive proteine strutturali nel fegato danneggiato4. La fibrogenesi dipende dalla comunicazione dinamica cellula-cellula tra diversi tipi di cellule epatiche. Le cellule stellate epatiche (HSC), quando attivate, si differenziano in cellule simili ai miofibroblasti alfa 2 che esprimono l'actina, migrano e proliferano e sintetizzano le proteine ECM come azione di chiusura della ferita. Le HSC attivate sono le cellule centrali produttrici di collagene nel fegato1.
Il meccanismo molecolare del rimodellamento della ECM, i modelli di fibrosi e la loro relazione con gli eventi cellulari non sono chiari. È ancora necessaria una migliore comprensione della struttura tridimensionale (3D) della ECM, anche se le tecniche di spettrometria di massa hanno contribuito ad analizzare la composizione della proteina ECM4. Tradizionalmente, la colorazione tricromatica di Masson, le macchie Picro Sirius Red e l'imaging di seconda generazione armonica (SHG) sono stati eseguiti su sezioni di fegato sottili bidimensionali (2D). Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato "filo di pollo", che si estende alla zona 3 ed è la fibrosi perisinusoidale / pericellulare 5,6. Tuttavia, c'è stata una mancanza di studi incentrati sulla struttura 3D del fegato nativo, in particolare quelli che non coinvolgono il sezionamento dei tessuti. Robusti approcci di imaging per identificare modelli e caratteristiche della fibrosi attraverso il rimodellamento dinamico della ECM nella fibrosi epatica rafforzerebbero significativamente la comprensione dei meccanismi della NASH e identificherebbero nuovi bersagli terapeutici.
Per affrontare queste sfide, è stato ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare l'ECM epatica nativa tramite decellularizzazione7. La decellularizzazione dell'intero fegato è un approccio per rimuovere il contenuto cellulare epatico mantenendo la rete ECM 3D nativa attraverso la perfusione di detergenti. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food (FFD) per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo perfusione venosa porta in situ con detergente delicato e basse portate per preservare le strutture di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. La microscopia a due fotoni è stata applicata per analizzare i cambiamenti nelle strutture del collagene nell'ECM. Le immagini 3D della struttura ECM nativa nei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L'esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l'analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni fornisce una piattaforma pratica e conveniente per visualizzare il rimodellamento dinamico dell'ECM nel fegato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

La steatoepatite non alcolica (NASH) è la malattia epatica cronica più comune negli Stati Uniti, che colpisce oltre 70 milioni di americani. La NASH può progredire verso la fibrosi e, infine, verso la cirrosi, un fattore di rischio significativo per il carcinoma epatocellulare. La matrice extracellulare (ECM) fornisce supporto strutturale e mantiene l'omeostasi epatica tramite segnali matricellulari. La fibrosi epatica deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della MEC ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di elementi strutturali e cambiamenti associati nei glicosaminoglicani. Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato "filo di pollo", che di solito consiste nella fibrosi perisinusoidale / pericellulare della zona 3, basata sulle caratteristiche osservate dalla colorazione tricromica di Masson e dalle macchie rosse di Picrosirius. Tuttavia, queste tradizionali tecniche di imaging basate su vetrini tissutali sottili (2D) non possono dimostrare i cambiamenti strutturali dettagliati tridimensionali (3D) della ECM, limitando la comprensione del rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica.
Il lavoro attuale ha ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare la struttura ECM nativa nel fegato tramite demilitarizzazione per affrontare le sfide di cui sopra. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo la perfusione della vena porta in situ e le tecniche di microscopia a due fotoni sono state applicate per visualizzare e analizzare i cambiamenti nella ECM nativa. Le immagini 3D dei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L'esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l'analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni hanno fornito una piattaforma pratica e affidabile per visualizzare il rimodellamento dinamico dell'ECM nel fegato.

Le fibre di collagene sono state rilevate con la seconda generazione armonica e la microscopia a due fotoni. Il segnale proviene dalle strutture frangibili di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. Non sono stati utilizzati anticorpi specifici per analizzare i sottotipi di collagene; Tuttavia, questo potrebbe essere aggiunto alla tecnica di imaging.
Quando il tessuto epatico viene studiato senza decellularizzazione, è difficile ottenere immagini ad alta risoluzione della rete di collag...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Il presente protocollo ottimizza i metodi di perfusione/decellularizzazione del fegato in situ e microscopia a due fotoni per stabilire una piattaforma affidabile per visualizzare la dinamica del rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) durante la steatoepatite non alcolica (NASH).

Imaging 3D della matrice extracellulare del fegato in un modello murino di steatoepatite non alcolica

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

La NASH è una delle più importanti malattie croniche del fegato al mondo. Può progredire in fibrosi, cirrosi e, infine, il cancro al fegato. Studiare il cambiamento dinamico della ECM nella NASH può aiutare a comprendere meglio la fibrosi.L'imaging tradizionale non può dimostrare cambiamenti nella struttura della ECM 3D, limitando la comprensione del processo di rimodellamento dinamico dell'ECM nella fibrosi epatica. Per iniziare, pesare il mouse prima della procedura. Dopo l'anestetizzazione, il topo rade l'area ventrale usando un tagliacapelli e disinfettare la pelle con etanolo al 70%.Posizionare il mouse sulla schiena e immobilizzare le gambe sulla scheda chirurgica con del nastro adesivo. Usa le forbici Mayo e la pinza Adson per fare un'incisione di tre centimetri lateralmente nell'addome inferiore. E poi un'incisione di cinque centimetri verticalmente dall'addome basso al processo xifoideo senza aprire la cavità toracica.Dopo aver aperto il peritoneo, posizionare delicatamente l'intestino alla sinistra dell'animale e sollevare il lobo destro del fegato con un applicatore con punta di rayon per esporre la vena porta. Per cateterizzare la vena porta, indurre un catetere IV di gauge 24 nell'estremità distale della vena porta. Posizionare la punta del catetere prima che la vena porta si dirama nei lobi epatici.Prelevare immediatamente l'ago quando il catetere entra nella vena. Controllare che il catetere sia posizionato correttamente all'interno della vena perfondendo il fegato con PBS utilizzando una siringa da un millilitro attraverso il catetere. Utilizzare una pinza Dumont micro, un microago Castroviejo e una sutura 4-0 per posizionare un punto sotto la ramificazione della vena porta e un secondo punto un centimetro sotto per fissare il catetere.Collegare il catetere a un tubo di silicone di un metro di lunghezza, tre millimetri di diametro interno e 4,1 millimetri di diametro esterno con un connettore esca. Collegare il tubo in silicone a una pompa peristaltica e un serbatoio contenente acqua deionizzata. Rimuovere con attenzione le bolle d'aria all'interno del tubo ed evitare di generare nuove bolle durante la perfusione.Impostare la pompa peristaltica su una portata di 0,2 millilitri al minuto. Esaminare prima con acqua deionizzata per due ore e il colore del fegato cambierà da rosso a giallo durante la perfusione. Passare la soluzione di perfusione allo 0,5% desossicolato di sodio e continuare durante la notte e il fegato diventerà bianco alla fine della perfusione.Passare la soluzione di perfusione in acqua deionizzata e perfondere per due ore. Utilizzare le micro pinze Dumont e le micro forbici a molla per raccogliere il fegato decellularizzato e lavarlo accuratamente in una capsula di Petri con PBS. Trasferire un piccolo pezzo di fegato decellularizzato su un vetrino da microscopio e posizionare il tessuto nel mezzo.Aggiungere 10 microlitri di mezzo di montaggio antisbiadimento al tessuto con una pipetta per evitare l'essiccazione del tessuto. Coprire il tessuto con un vetro di copertura e applicare una piccola forza per appiattire il campione. Sigillare i bordi del vetro di copertura con smalto incolore e trasparente.Posizionare una goccia di olio ad immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e posizionare il vetrino sul supporto del vetrino del microscopio. Abbassare l'obiettivo dell'olio 20X fino a quando non entra in contatto con l'olio ad immersione. Passare al canale viola di lunghezza d'onda 405 nanometri.Accendere l'otturatore e mettere a fuoco il campione. Naviga e posiziona l'area di interesse per l'imaging. Spegnere l'otturatore prima di passare all'acquisizione delle immagini utilizzando la luce laser.Per avviare il laser a due fotoni, passare al controllo del computer e accendere prima il laser a due fotoni. Quindi accendere il controller laser a due fotoni e l'otturatore assicurandosi che la potenza di uscita sia superiore a 2,5 watt. Ridurre la potenza del laser per prevenire la tempra a fluorescenza.Selezionare e regolare i rilevatori sia i moltiplicatori fotografici che l'ibrido per adattarsi ai fluorofori scelti. Scegli acquisizioni di immagini simultanee o sequenziali. Regolate il foro stenopeico sul valore più alto.Regola le lunghezze d'onda del laser, il guadagno, la potenza, l'offset del tempo di permanenza dei pixel, la media delle dimensioni dei pixel e lo zoom. Scorrere il controller Z del computer e impostare le dimensioni Z. Definisci l'inizio e gli estremi e scegli il numero di immagini fornite all'interno di un volume.Acquisire immagini. Dopo aver eseguito la microscopia a due fotoni, le fibre di collagene senza decellularizzazione hanno rivelato un'immagine a bassa risoluzione della rete di collagene. Nella matrice extracellulare decellularizzata, sono state osservate differenze apparenti nella morfologia e nella distribuzione spaziale tra fegati di dieta chow e fast food.Le fibre di collagene e i topi su una dieta chow hanno mostrato una rete intrecciata e ben organizzata, mentre i topi sulla dieta fast food hanno mostrato fasci di collagene con meno connettività. La struttura tridimensionale della matrice extracellulare del fegato mostra che le fibre di collagene nei topi sulla dieta chow hanno mostrato una rete ben organizzata, ma non nei topi dietetici fast food. Per confermare la qualità del collagene fibrillare nella matrice extracellulare decellularizzata, i vetrini sono stati colorati con Eosina ematossilina e rosso Picrosirius.L'ematossilina e l'eosina mostrano che tutte le cellule sono state rimosse. Nelle immagini della colorazione rossa di Picrosirius, la matrice extracellulare dei topi alimentati con chow ha rivelato una rete ben organizzata. E al contrario, i topi con dieta fast food hanno mostrato fibre di collagene più dense.Rimuovere con attenzione la bolla all'interno di un tubo prima della perfusione. La bolla bloccherà la nave nel fegato e influenzerà la perfusione.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Ricerca

Medicina

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

Incorporazione di una procedura di biopsia del fegato Survivable in topi, per valutare la risoluzione di steatoepatite Non alcolica (NASH)

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

Trattamento farmacologico mediante catetere venoso centrale in un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da angiotensina II e monitoraggio mediante ecografia 3D

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Studio degli effetti protettivi del platicodina D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto da acido palmitico

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Delivery of Cardioactive Therapeutics in a Porcine Myocardial Infarction Model

Somministrazione di terapie cardioattive in un modello di infarto miocardico suino

Myocardial infarction is one of the leading causes of death and disability worldwide, and there is an urgent need for novel cardioprotective or ...

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

Enhancing Transplantation Research Through MicroCT Angiography in Murine Models (Video) | JoVE

Trapianto ortotopico di fegato di successo nei topi che utilizzano l'angiografia con tomografia microcomputerizzata

Microcomputed tomography (microCT) angiography is an invaluable resource to researchers. New advances in this technology have allowed for high-quality ...