Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
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技術的な支援をしてくれたHyesuk Parkに感謝します。この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)、NIH(R01 2DK083283、NJT)、国立老化研究所(NIA)、NIH(1R01AG060726、NJT)からの資金提供によって支援されました。ベックマンセンターの細胞科学イメージング施設のジョン・マルホランドとキティ・リーが、2光子顕微鏡イメージングの技術支援をしてくれたことに感謝します。

動物実験は、スタンフォード大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)およびパロアルトの退役軍人病院によって承認された実験手順に従って行われます。6〜8週齢の雄C57BL / 6Jマウスに、飲料水中の4.2%高果糖コーンシロップ( 材料の表を参照)を添加した固形飼料またはファーストフード食のいずれかを14週間与えました5。マウスは、12時間の暗/明サイクルで標...

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本プロトコルは、低流速DOC in situ灌流による脱細胞化が、壊れやすいトリプルヘリカルおよび天然の原線維コラーゲン構造を保存し、NASH肝線維症における動的ECMリモデリングを捕捉するための信頼性が高く費用効果の高いプラットフォームを提供することを示しています。ECM成分を同定したり、細胞培養用の生物学的足場を生成したりする前に、正常および線維性の肝臓で脱細胞化が?...

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は最も一般的な肝疾患であり、成人人口の20%〜25%に影響を及ぼします。NAFLD患者の25%が非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に進行し、肝硬変、肝不全、肝細胞癌のリスクが高まります1。今後20年間で、NASHは米国2で200万人の肝臓関連の死亡を占めると推定されています。承認された治療法がないため、NASH患者の肝線維化を引き起こすメカニズムを解読し、標的治療を開発することが急務です3。
細胞外マトリックス(ECM)は、細胞との双方向通信を発揮して組織の恒常性を調節する動的で複雑な微小環境です4。肝臓ECMは、プロテオグリカン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、および他の非構造タンパク質(例えば、オルファクトメジンおよびトロンボスポンジン)などの構造要素で構成され、物理的および構造的支持体を提供する4。
肝線維症は、NASH3を含むさまざまな病因の肝障害に対する慢性創傷治癒反応です。これは、動的ECMマトリックスリモデリングプロセスの不均衡に起因し、損傷した肝臓4における過剰な構造タンパク質によって特徴付けられる。線維形成は、異なる肝細胞型間の動的な細胞間コミュニケーションに依存する。肝星細胞(HSC)は、活性化されると、平滑筋アルファ2アクチン発現、遊走、および増殖筋線維芽細胞様細胞に分化し、創傷閉鎖作用としてECMタンパク質を合成します。活性化造血幹細胞は、肝臓1の中心コラーゲン産生細胞である。
ECMリモデリングの分子メカニズム、線維症のパターン、および細胞イベントとの関係は明らかではありません。質量分析技術がECMタンパク質組成の分析に役立ったとしても、3次元(3D)ECM構造のより良い理解が依然として必要です4。伝統的に、マッソンのトリクローム染色、ピクロシリウスレッド染色、および第2高調波発生(SHG)イメージングは、2次元(2D)の薄い肝臓切片で行われてきました。NASHの典型的な線維症パターンは「チキンワイヤー」と呼ばれ、ゾーン3まで伸び、類洞周囲/細胞周囲線維症です5,6。しかし、天然肝臓の3D構造、特に組織切片を伴わない研究が不足しています。肝線維症における動的ECMリモデリング全体を通して線維症のパターンと特徴を特定するための堅牢なイメージングアプローチは、NASHメカニズムの理解を大幅に強化し、新しい治療標的を特定します。
これらの課題に対処するために、高速で効率的なプロトコルを最適化して、脱細胞化 を介して ネイティブの肝臓ECMをイメージングしました7。全肝臓脱細胞化は、界面活性剤灌流を通じてネイティブ3D ECMネットワークを維持しながら、肝細胞含有量を除去するアプローチです。マウスに、固形飼料またはファーストフード食(FFD)のいずれかを14週間与えた。脱細胞化は、トリプルヘリカルおよびネイティブの原線維コラーゲン構造を維持するために、中性洗剤および低流速によるin situ 門脈灌流後に実行されました。ECMにおけるコラーゲン構造の変化を解析するために、二光子顕微鏡を適用した。正常およびNASH肝臓における天然ECM構造の3D画像を再構成し、分析した。 in situ 灌流脱細胞化を行い、2光子顕微鏡で足場を分析することで、肝臓の動的ECMリモデリングを視覚化するための実用的で手頃なプラットフォームが提供されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、米国で最も一般的な慢性肝疾患であり、7,000万人以上のアメリカ人が罹患しています。NASHは線維症に進行し、最終的には肝細胞癌の重要な危険因子である肝硬変に進行する可能性があります。細胞外マトリックス(ECM)は、構造的サポートを提供し、母細胞シグナル を介して 肝臓の恒常性を維持します。肝線維症は、動的ECMリモデリングプロセスの不均衡に起因し、構造要素の過剰な蓄積とそれに伴うグリコサミノグリカンの変化を特徴としています。NASHの典型的な線維症パターンは「チキンワイヤー」と呼ばれ、マッソンのトリクローム染色とピクロシリウスレッド染色によって観察された特徴に基づいて、通常、ゾーン3の類洞周囲/細胞周囲線維症で構成されます。しかし、これらの従来の薄い2次元(2D)組織スライドベースのイメージング技術は、詳細な3次元(3D)ECM構造変化を実証することができず、肝線維症における動的ECMリモデリングの理解を制限します。
現在の研究では、上記の課題に対処するために、脱細胞化 を介して 肝臓のネイティブECM構造を画像化するための高速で効率的なプロトコルを最適化しました。マウスに固形飼料またはファーストフード食のいずれかを14週間与えた。その 場 門脈灌流後に脱細胞化を行い、2光子顕微鏡技術を適用してネイティブECMの変化を画像化および分析しました。正常肝臓とNASH肝臓の3D画像を再構成して分析しました。 in situ 灌流脱細胞化を行い、2光子顕微鏡で足場を分析することで、肝臓の動的ECMリモデリングを視覚化するための実用的で信頼性の高いプラットフォームが提供されました。

コラーゲン線維は、第2高調波発生および2光子顕微鏡で検出されました。シグナルは、壊れやすいトリプルヘリカルおよび天然の原線維コラーゲン構造からのものです。特異的抗体はコラーゲンサブタイプの分析には使用しなかった。ただし、これはイメージング技術に追加できます。
肝臓組織を脱細胞化せずに研究する場合、コラーゲンネットワークの高解像度画像を...

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3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

本プロトコルは、肝臓 のin situ 灌流/脱細胞化および2光子顕微鏡法を最適化して、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)中の細胞外マトリックス(ECM)リモデリングのダイナミクスを視覚化するための信頼性の高いプラットフォームを確立します。

非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおける肝臓細胞外マトリックスの3Dイメージング

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASHは、世界で最も重要な慢性肝疾患の1つです。それは線維症、肝硬変、そして最終的には肝臓癌に進行する可能性があります。NASHにおけるECMの動的変化を研究することは、線維症をよりよく理解するのを助けることができる。従来のイメージングでは、3D ECM構造の変化を実証できず、肝線維症における動的ECMリモデリングプロセスの理解が制限されています。開始するには、手順の前にマウスの重量を量ります。マウスを麻酔した後、バリカンを用いて腹側を剃り、70%エタノールで皮膚を消毒する。マウスを背中に置き、脚をテープで手術用ボードに固定します。メイヨーハサミとアドソン鉗子を使用して、下腹部を横方向に3センチ切開します。そして、胸腔を開かずに下腹部から剣状突起まで垂直に5センチメートルの切開を行います。腹膜を開いた後、腸を動物の左側にそっと置き、レーヨン先端のアプリケーターで肝臓の右葉を持ち上げて門脈を露出させます。門脈をカテーテル挿入するには、24ゲージのIVカテーテルを門脈の遠位端に誘導します。門脈が肝葉に分岐する前にカテーテルの先端を配置します。カテーテルが静脈に入ったらすぐに針を抜いてください。カテーテルを介して1ミリリットルの注射器を使用して肝臓をPBSに灌流することにより、カテーテルが静脈内に正しく配置されていることを確認します。デュモンマイクロ鉗子、カストロビエホマイクロニードル、および4-0縫合糸を使用して、門脈の分岐の下にステッチを配置し、1センチメートル下に2番目のステッチを配置してカテーテルを固定します。長さ1メートル、内径3ミリ、外径4.1ミリのシリコンチューブにルアーコネクターでカテーテルを接続します。シリコンチューブを蠕動ポンプと脱イオン水を含むリザーバーに接続します。チューブ内の気泡を慎重に取り除き、灌流中に新しい気泡が発生しないようにしてください。蠕動ポンプの流量を毎分0.2ミリリットルに設定します。最初に脱イオン水で2時間熟読すると、灌流中に肝臓の色が赤から黄色に変わります。灌流溶液を0.5%デオキシコール酸ナトリウムに切り替えて一晩続けると、灌流の終わりに肝臓が白くなります。灌流溶液を脱イオン水に切り替え、2時間灌流します。デュモンマイクロ鉗子とマイクロスプリングハサミを使用して脱細胞化された肝臓を収集し、PBSを含むペトリ皿で注意深く洗います。脱細胞化肝臓の小片を顕微鏡スライドに移し、組織を中央に置きます。組織の乾燥を防ぐために、ピペットで10マイクロリットルの退色防止封入剤を組織に追加します。組織をカバーガラスで覆い、小さな力を加えてサンプルを平らにします。カバーガラスの端を無色透明のマニキュアでシールします。カバーガラスの上部に液浸油を一滴置き、スライドを顕微鏡スライドホルダーに置きます。20倍のオイル対物レンズを液浸オイルに接触するまで下げます。波長405ナノメートルの紫色チャンネルに切り替えます。シャッターをオンにして、サンプルにピントを合わせます。イメージングの対象地域をナビゲートして配置します。レーザー光による画像取得に移行する前に、シャッターを切ってください。2光子レーザーを開始するには、コンピューター制御に切り替えて、最初に2光子レーザーをオンにします。次に、2つの光子レーザーコントローラーとシャッターをオンにして、出力電力が2.5ワットを超えていることを確認します。レーザー出力を下げて、蛍光消光を防ぎます。光電子増倍管とハイブリッドの両方の検出器を選択して調整し、選択した蛍光色素に対応します。同時または順次画像取得を選択します。ピンホールを最高値に調整します。レーザー波長、ゲイン、パワーの調整、ピクセル滞留時間のオフセット、ピクセルサイズの平均化、ズームを行います。コンピューターの Z コントローラーをスクロールし、Z 寸法を設定します。開始点と終了点を定義し、ボリューム内で指定するイメージの数を選択します。画像を取得します。2つの光子顕微鏡観察を行った後、脱細胞化を伴わないコラーゲン線維は、コラーゲンネットワークの低解像度画像を明らかにした。脱細胞化細胞外マトリックスでは、固形飼料とファーストフード食の肝臓の形態と空間分布に明らかな違いが観察されました。コラーゲン繊維と飼料のマウスは、織り交ぜられたよく組織化されたネットワークを示しましたが、ファーストフードのマウスは、接続性の低いコラーゲン束を示しました。肝臓細胞外マトリックスの三次元構造は、固形飼料のマウスのコラーゲン繊維がよく組織化されたネットワークを示したが、ファーストフードの飼料マウスでは示されなかったことを示している。脱細胞化細胞外マトリックス中の原線維性コラーゲンの品質を確認するために、スライドをヘマトキシリンエオシンおよびピクロシリウスレッドで染色した。ヘマトキシリンとエオシンは、すべての細胞が除去されたことを示しています。Picrosirius赤色染色画像では、飼料給餌マウスからの細胞外マトリックスは、よく組織化されたネットワークを明らかにしました。対照的に、ファーストフード食のマウスは、より密度の高いコラーゲン繊維を示しました。灌流の前に、チューブ内の気泡を慎重に取り除きます。泡は肝臓の血管を塞ぎ、灌流に影響を与えます。

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) の解像度を評価するためにマウスで存続可能肝生検の手順の定款

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

アンジオテンシンII誘発腹部大動脈瘤のマウスモデルにおける中心静脈カテーテルによる薬物治療と3D超音波によるモニタリング

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

パルミチン酸誘発 In vitro モデルにおける非アルコール性脂肪性肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果の調査

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

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ブタ心筋梗塞モデルにおける心役活性治療薬の送達

Myocardial infarction is one of the leading causes of death and disability worldwide, and there is an urgent need for novel cardioprotective or ...

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

Enhancing Transplantation Research Through MicroCT Angiography in Murine Models (Video) | JoVE

マイクロコンピュータ断層撮影血管造影を用いたマウスの同所性肝移植の成功

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