Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
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기술적인 도움을 주신 박혜석 의원님께 감사드립니다. 이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, NJT), 국립 노화 연구소 (NIA), NIH (1R01AG060726, NJT)의 자금 지원으로 지원되었습니다. 이광자 현미경 이미징에 대한 기술 지원을 제공한 Beckman Center의 Cell Sciences Imaging Facility의 Jon Mulholland와 Kitty Lee에게 감사드립니다.

동물 실험은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUCs)와 팔로 알토의 재향 군인 병원에서 승인 한 실험 절차에 따라 수행됩니다. 6-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에게 14주 동안 식수에 4.2% 고과당 옥수수 시럽( 표 참조)이 첨가된 사료 또는 패스트푸드 사료를 먹였다5. 마우스는 12시간 어두운/밝은 주기로 표준 케이지에 보관되었습니다.
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	<li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis:+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future.">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence,+incidence,+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li><li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis.">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li><li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens.">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).</li><li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging.">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li><li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes.">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition.">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83 (2019).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue.">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398 (2016).</li><li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices.">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li><li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+cancer:+A+strained+relationship.">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).</li><li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrix+in+cancer.">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li><li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

현재 프로토콜은 저유속 DOC in situ 관류를 통한 탈세포화가 부서지기 쉬운 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하여 NASH 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링을 캡처하기 위한 안정적이고 비용 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 보여줍니다. ECM 성분을 확인하거나 세포 배양을 위한 생물학적 스캐폴드를 생성하기 전에 정상 및 섬유성 간에서 탈세포화를 수행했지만, 간 섬유증에서 ECM...

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 성인 인구의 20%-25%에 영향을 미치는 가장 흔한 간 질환입니다. NAFLD 환자의 25%는 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행되며, 여기서 간경변, 간부전 및 간세포 암종의 위험이 증가합니다1. 향후 20년 동안 NASH는 미국에서 200만 명의 간 관련 사망을 차지할 것으로 추정됩니다. 승인된 치료법이 없기 때문에 NASH 환자에서 간 섬유증을 유발하는 메커니즘을 해독하고 표적 치료법을 개발하는 것이 시급합니다3.
세포외 기질(ECM)은 조직 항상성을 조절하기 위해 세포와 양방향 통신을 발휘하는 역동적이고 복잡한 미세환경이다4. 간 ECM은 프로테오글리칸, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 기타 비구조적 단백질(예: 올팩토메딘 및 트롬보스폰딘)과 같은 구조적 요소로 구성되어 물리적 및 구조적 지지를 제공한다4.
간 섬유증은 NASH3를 포함한 다양한 병인의 간 손상에 대한 만성 상처 치유 반응입니다. 이는 동적 ECM 매트릭스 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 손상된 간에서 과도한 구조 단백질을 특징으로 합니다4. 섬유 형성은 서로 다른 간 세포 유형 간의 동적 세포-세포 통신에 달려 있습니다. 간 성상 세포(HSC)가 활성화되면 평활근 알파 2 액틴 발현, 이동 및 증식 근섬유아세포 유사 세포로 분화하고 상처 봉합 작용으로 ECM 단백질을 합성합니다. 활성화된 HSC는 간에서 콜라겐을 생성하는 세포의 중심입니다1.
ECM 리모델링의 분자 메커니즘, 섬유증의 패턴 및 세포 사건과의 관계는 명확하지 않습니다. 3차원(3D) ECM 구조에 대한 더 나은 이해는 질량분석법 기술이 ECM 단백질 조성을 분석하는 데 도움이 되었음에도 불구하고 여전히 필요하다4. 전통적으로 Masson의 삼색 염색, Picro Sirius Red 염색 및 SHG(2차 고조파 생성) 이미징은 2차원(2D) 얇은 간 섹션에서 수행되었습니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 "치킨 와이어"라고 불리며, 이는 영역 3까지 확장되며 perisinusoidal/pericellular fibrosis 5,6입니다. 그러나 천연 간의 3D 구조, 특히 조직 절편을 포함하지 않는 연구에 초점을 맞춘 연구가 부족했습니다. 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링 전반에 걸쳐 섬유증의 패턴과 특성을 식별하기 위한 강력한 이미징 접근 방식은 NASH 메커니즘에 대한 이해를 크게 강화하고 새로운 치료 표적을 식별할 것입니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 탈세포화(decellularization)를 통해 천연 간 ECM을 이미지화하도록 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다7. 전체 간 탈세포화는 세제 관류를 통해 기본 3D ECM 네트워크를 유지하면서 간 세포 내용물을 제거하는 접근 방식입니다. 마우스는 14주 동안 차우 또는 패스트푸드 식단(FFD)을 먹였습니다. 탈세포화는 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하기 위해 중성 세제와 낮은 유속으로 현장 문맥 관류 후 수행되었습니다. ECM의 콜라겐 구조 변화를 분석하기 위해 이광자 현미경을 적용했습니다. 정상 및 NASH 간에서 기본 ECM 구조의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석하면 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 저렴한 플랫폼을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

비알코올성 지방간염(NASH)은 미국에서 가장 흔한 만성 간 질환으로 7천만 명 이상의 미국인에게 영향을 미칩니다. NASH는 섬유증으로 진행될 수 있으며 결국 간세포 암종의 중요한 위험 요소인 간경변으로 진행될 수 있습니다. 세포외 기질(ECM)은 구조적 지원을 제공하고 모세포 신호를 통해 간 항상성을 유지합니다. 간 섬유증은 동적 ECM 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 구조 요소의 과도한 축적 및 글리코사미노글리칸의 관련 변화를 특징으로 합니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 "치킨 와이어"라고 불리며, 일반적으로 Masson의 삼색 염색과 Picrosirius Red 염색에 의해 관찰되는 특징을 기반으로 영역 3 perisinusoidal/pericellular 섬유증으로 구성됩니다. 그러나 이러한 기존의 얇은 2차원(2D) 조직 슬라이드 기반 이미징 기술은 상세한 3차원(3D) ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링에 대한 이해를 제한합니다.
현재 작업은 위의 문제를 해결하기 위해 탈세포화를 통해 간의 기본 ECM 구조를 이미지화하는 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다. 쥐에게 14주 동안 차우나 패스트푸드 식단을 먹였습니다. 제자리 문맥 관류 후 탈세포화를 수행하고, 이광자 현미경 기술을 적용하여 천연 ECM의 변화를 이미지화하고 분석했습니다. 정상 간과 NASH 간의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석함으로써 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공했습니다.

콜라겐 섬유는 2차 고조파 생성 및 이광자 현미경으로 검출되었습니다. 신호는 부서지기 쉬운 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조에서 비롯됩니다. 콜라겐 아형을 분석하기 위해 특정 항체를 사용하지 않았습니다. 그러나 이것은 이미징 기술에 추가될 수 있습니다.
탈세포화 없이 간 조직을 연구할 때 콜라겐 네트워크의 고해상도 이미지를 얻는 것은 어렵습니다 (<str...

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3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

현재 프로토콜은 비알코올성 지방간염(NASH) 동안 세포외 기질(ECM) 리모델링의 역학을 시각화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축하기 위해 간 상피내 관류/탈세포화 및 이광자 현미경 방법을 최적화합니다.

비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH는 세계에서 가장 중요한 만성 간 질환 중 하나입니다. 섬유증, 간경변, 결국 간암으로 진행될 수 있습니다. NASH에서 ECM의 동적 변화를 연구하면 섬유증을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.기존의 이미징은 3D ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링 과정에 대한 이해를 제한합니다. 시작하려면 절차 전에 마우스의 무게를 잰다. 마우스를 마취시킨 후 이발기로 복부 부위를 면도하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다.마우스를 뒤쪽에 놓고 테이프로 수술 보드에 다리를 고정시킵니다. Mayo 가위와 Adson 집게를 사용하여 하복부에서 측면으로 3cm 절개를합니다. 그런 다음 흉강을 열지 않고 하복부에서 xiphoid 과정까지 수직으로 5cm 절개합니다.복막을 연 후 장을 동물의 왼쪽에 부드럽게 놓고 레이온 팁 어플리케이터로 간 오른쪽 엽을 들어 올려 문맥을 노출시킵니다. 문맥을 카테터로 삽입하려면 24게이지 IV 카테터를 문맥의 말단부에 유도합니다. 문맥이 간엽으로 분기되기 전에 카테터 팁을 놓습니다.카테터가 정맥에 들어가면 즉시 바늘을 빼십시오. 카테터를 통해 1밀리리터 주사기를 사용하여 PBS로 간을 관류하여 카테터가 정맥 내부에 올바르게 위치하는지 확인합니다. Dumont 마이크로 집게, Castroviejo 미세 바늘 및 4-0 봉합사를 사용하여 문맥 분기 아래에 스티치를 배치하고 1cm 아래에 두 번째 스티치를 배치하여 카테터를 고정합니다.카테터를 루어 커넥터로 길이 1m, 내경 3mm, 외경 4.1mm의 실리콘 튜브에 연결합니다. 실리콘 튜브를 연동 펌프와 탈이온수가 들어 있는 저장소에 연결합니다. 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하고 관류 중에 새로운 기포가 생성되지 않도록 하십시오.연동 펌프를 분당 0.2밀리리터의 유량 출력으로 설정합니다. 먼저 탈이온수로 2시간 동안 정독하면 관류 중에 간의 색이 빨간색에서 노란색으로 바뀝니다. 관류 용액을 0.5% 데옥시콜산나트륨으로 전환하고 밤새 계속하면 관류가 끝날 때 간이 하얗게 됩니다.관류 용액을 탈이온수로 전환하고 2시간 동안 관류합니다. Dumont 마이크로 집게와 마이크로 스프링 가위를 사용하여 탈세포화된 간을 채취하고 PBS가 포함된 페트리 접시에서 조심스럽게 씻습니다. 탈세포화된 간의 작은 조각을 현미경 슬라이드로 옮기고 조직을 중간에 놓습니다.조직 건조를 방지하기 위해 피펫으로 10마이크로리터의 퇴색 방지 장착 매체를 조직에 추가합니다. 커버 유리로 조직을 덮고 작은 힘을 가하여 샘플을 평평하게 만듭니다. 커버 유리의 가장자리를 무색 투명 매니큐어로 밀봉하십시오.커버 유리 상단에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨리고 현미경 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다. 20X 오일 대물 렌즈가 이멀젼 오일에 닿을 때까지 내립니다. 파장 405 나노 미터의 보라색 채널로 전환하십시오.셔터를 켜고 샘플의 초점을 맞춥니다. 이미징을 위해 관심 영역을 탐색하고 배치합니다. 레이저 광을 사용한 이미지 획득으로 이동하기 전에 셔터를 끄십시오.2 광자 레이저를 시작하려면 컴퓨터 제어로 전환하고 먼저 2 광자 레이저를 켭니다. 그런 다음 두 개의 광자 레이저 컨트롤러와 셔터를 켜서 출력 전력이 2.5와트보다 높은지 확인합니다. 형광 소광을 방지하기 위해 레이저 출력을 줄입니다.선택한 형광단을 수용하기 위해 광증배관과 하이브리드를 모두 선택하고 조정하십시오. 동시 또는 순차적 이미지 획득을 선택합니다. 핀홀을 가장 높은 값으로 조정합니다.레이저 파장, 게인, 파워를 조정하고, 픽셀 체류 시간 오프셋, 픽셀 크기 평균화 및 확대/축소를 수행합니다. 컴퓨터 Z 컨트롤러를 스크롤하고 Z 치수를 설정합니다. 시작 및 끝점을 정의하고 볼륨 내에 지정된 이미지 수를 선택합니다.이미지를 획득합니다. 두 광자 현미경을 수행한 후, 탈세포화되지 않은 콜라겐 섬유는 콜라겐 네트워크의 저해상도 이미지를 나타냈습니다. 탈세포화된 세포외 기질에서, 차우와 패스트푸드 식단 간 사이의 형태 및 공간 분포에서 명백한 차이가 관찰되었습니다.차우 다이어트를 한 콜라겐 섬유와 마우스는 서로 얽히고 잘 조직된 네트워크를 보인 반면, 패스트푸드 다이어트를 한 마우스는 연결성이 낮은 콜라겐 다발을 보여주었습니다. 간 세포외 기질의 3차원 구조는 차우 다이어트를 한 쥐의 콜라겐 섬유가 잘 조직된 네트워크를 보였지만 패스트푸드 다이어트 마우스에서는 그렇지 않았음을 보여줍니다. 탈세포화된 세포외 기질에서 원섬유 콜라겐의 품질을 확인하기 위해, 슬라이드를 헤마톡실린 에오신 및 피크로시리우스 레드로 염색하였다.헤마톡실린과 에오신은 모든 세포가 제거되었음을 보여줍니다. Picrosirius red 염색 이미지에서, 차우 먹인 쥐의 세포 외 기질은 잘 조직 된 네트워크를 나타냈다. 대조적으로, 패스트 푸드 다이어트를하는 쥐는 더 조밀 한 콜라겐 섬유를 보여주었습니다.관류하기 전에 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 거품은 간에서 혈관을 막고 관류에 영향을 미칩니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

연구

의학

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

무알코올 Steatohepatitis (NASH) 해상도 평가 하기 위해 쥐에 지속 가능 간 생 검 절차의

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

뮤린 정밀 절단 간 슬라이스 간 생물학의 Ex Vivo 모델로

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

안지오텐신 II의 마우스 모델에서 중앙 정맥 카테터에 의한 약물 치료 유도 복부 대동맥류 및 3D 초음파에 의한 모니터링

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Palmitic Acid-Induced In Vitro 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 Platycodin D의 보호 효과 조사

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Delivery of Cardioactive Therapeutics in a Porcine Myocardial Infarction Model

돼지 심근 경색 모델에서 심장 활성 치료제 전달

Myocardial infarction is one of the leading causes of death and disability worldwide, and there is an urgent need for novel cardioprotective or ...

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

Enhancing Transplantation Research Through MicroCT Angiography in Murine Models (Video) | JoVE

Microcomputed Tomography 혈관 조영술을 활용한 마우스의 성공적인 Orthotopic 간 이식

Microcomputed tomography (microCT) angiography is an invaluable resource to researchers. New advances in this technology have allowed for high-quality ...