Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

Agradecemos ao Hyesuk Park pela ajuda técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, para NJT), o Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA), NIH (1R01AG060726, para NJT). Agradecemos a Jon Mulholland e Kitty Lee, do Cell Sciences Imaging Facility do Beckman Center, pela assistência técnica com a imagem de microscopia de dois fótons.

Os experimentos com animais são realizados de acordo com os procedimentos experimentais aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais (IACUCs) da Universidade de Stanford e do Hospital de Assuntos de Veteranos em Palo Alto. Camundongos C57BL/6J machos de 6-8 semanas de idade foram alimentados com ração ou dieta fast-food suplementada com 4,2% de xarope de milho com alto teor de frutose (ver Tabela de Materiais) em água potável por 14 semanas5. Os camund...

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S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

O presente protocolo mostra que a decelularização através de uma perfusão in situ de COD de baixa taxa de fluxo preserva as estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo, fornecendo uma plataforma confiável e econômica para capturar o remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática da EHNA. Embora a descelularização tenha sido realizada em fígados normais e fibróticos antes da identificação dos componentes da MEC ou da geração de scaffolds biológicos para cultura celu...

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a doença hepática mais comum, afetando 20%-25% da população adulta. 25% dos pacientes com DHGNA evoluem para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), onde o risco de cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular aumenta1. Nos próximos 20 anos, estima-se que a EHNA será responsável por 2 milhões de mortes relacionadas ao fígado nos EUA2. Como não existem tratamentos aprovados, há uma necessidade urgente de decifrar os mecanismos que causam fibrose hepática em pacientes com EHNA e desenvolver tratamento direcionado3.
A matriz extracelular (MEC) é um microambiente dinâmico e complexo que exerce comunicação bidirecional com as células para regular a homeostasetecidual4. A MEC hepática é composta por elementos estruturais como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina e outras proteínas não estruturais (por exemplo, olfactomedina e trombospondina) para fornecer suporte físico e estrutural4.
A fibrose hepática é uma resposta crônica da cicatrização de feridas ao dano hepático de várias etiologias, incluindo a EHNA3. Resulta de um desequilíbrio no processo dinâmico de remodelamento da matriz da MEC e é caracterizada pelo excesso de proteínas estruturais no fígado lesado4. A fibrogênese depende da comunicação dinâmica célula-célula entre diferentes tipos de células hepáticas. As células estreladas hepáticas (CTHs), quando ativadas, diferenciam-se em células do músculo liso alfa 2 que expressam, migram e proliferam miofibroblastos como células e sintetizam proteínas da MEC como uma ação de fechamento da ferida. As CTHs ativadas são as células centrais produtoras de colágeno no fígado1.
O mecanismo molecular do remodelamento da MEC, os padrões de fibrose e sua relação com eventos celulares não estão claros. Um melhor entendimento da estrutura tridimensional (3D) da MEC ainda é necessário, embora técnicas de espectrometria de massa tenham ajudado a analisar a composição proteica da MEC4. Tradicionalmente, a coloração tricrômico de Masson, as colorações Picro Sirius Red e a imagem de segunda geração harmônica (SHG) têm sido realizadas em cortes bidimensionais (2D) finos do fígado. O padrão típico de fibrose da EHNA é denominado "fio de galinha", que se estende até a zona 3 e é fibrose perissinusoidal/pericelular5,6. No entanto, há uma carência de estudos enfocando a estrutura 3D do fígado nativo, particularmente aqueles que não envolvem secção tecidual. Abordagens de imagem robustas para identificar padrões e características da fibrose ao longo do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática fortaleceriam significativamente a compreensão dos mecanismos da EHNA e identificariam novos alvos terapêuticos.
Para enfrentar esses desafios, um protocolo rápido e eficiente foi otimizado para obtenção de imagens da MEC hepática nativa via decelularização7. A descelularização do fígado total é uma abordagem para remover o conteúdo celular hepático enquanto mantém a rede nativa de MEC 3D através da perfusão em detergente. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food (FFD) por 14 semanas. A decelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta com detergente neutro e baixo fluxo, para preservar estruturas de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. A microscopia de dois fótons foi aplicada para analisar as alterações nas estruturas do colágeno na MEC. As imagens 3D da estrutura da MEC nativa em fígados normais e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização da perfusão in situ e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons fornecem uma plataforma prática e acessível para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

A esteatohepatite não alcoólica (EHNA) é a doença hepática crônica mais comum nos Estados Unidos, afetando mais de 70 milhões de americanos. A EHNA pode evoluir para fibrose e, eventualmente, para cirrose, um importante fator de risco para carcinoma hepatocelular. A matriz extracelular (MEC) fornece suporte estrutural e mantém a homeostase hepática via sinais matricelulares. A fibrose hepática resulta de um desequilíbrio no processo de remodelamento dinâmico da MEC e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de elementos estruturais e alterações associadas nos glicosaminoglicanos. O padrão típico de fibrose da EHNA é chamado de "fio de galinha", que geralmente consiste em fibrose perissinusoidal/pericelular da zona 3, com base nas características observadas pela coloração tricrômico de Masson e pelo vermelho de Picrosirius. No entanto, essas técnicas tradicionais de imagem em lâminas de tecido fino bidimensional (2D) não podem demonstrar as alterações estruturais detalhadas da MEC tridimensional (3D), limitando a compreensão do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática.
O trabalho atual otimizou um protocolo rápido e eficiente para obter imagens da estrutura nativa da MEC no fígado via decelularização para enfrentar os desafios acima. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food por 14 semanas. A descelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta, e as técnicas de microscopia de dois fótons foram aplicadas para imagear e analisar as alterações na MEC nativa. As imagens 3D dos fígados normal e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização in situ da perfusão e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons forneceram uma plataforma prática e confiável para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.

As fibras colágenas foram detectadas com segunda geração harmônica e microscopia de dois fótons. O sinal é proveniente das estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. Não foram utilizados anticorpos específicos para analisar os subtipos de colágeno; no entanto, isso poderia ser adicionado à técnica de imagem.
Quando o tecido hepático é estudado sem descelularização, é difícil obter imagens de alta resolução da rede de colágeno (<strong c...

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3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

A EHNA é uma das mais importantes doenças hepáticas crônicas do mundo. Pode evoluir para fibrose, cirrose e, eventualmente, câncer de fígado. Estudar a alteração dinâmica da MEC na EHNA pode ajudar a entender melhor a fibrose.Tradicionalmente os exames de imagem não conseguem demonstrar alterações estruturais da MEC 3D, limitando a compreensão do processo de remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática. Para começar, pese o mouse antes do procedimento. Após anestesiar o camundongo, raspe a área ventral com um cortador de cabelo e desinfete a pele com etanol 70%.Coloque o mouse nas costas e imobilize as pernas na prancha cirúrgica com fita adesiva. Use tesoura Mayo e pinça Adson para fazer uma incisão de três centímetros lateralmente no abdômen inferior. E então uma incisão de cinco centímetros verticalmente do abdome baixo para o processo xifoide sem abrir a cavidade torácica.Após a abertura do peritônio, coloque suavemente os intestinos à esquerda do animal e eleve o lobo direito do fígado com um aplicador com ponta de rayon para expor a veia porta. Para cateterizar a veia porta, induzir um cateter IV de calibre 24 na extremidade distal da veia porta. Coloque a ponta do cateter antes que a veia porta se ramifica para os lobos hepáticos.Retire a agulha imediatamente quando o cateter entrar na veia. Verifique se o cateter está corretamente posicionado dentro da veia perfundindo o fígado com PBS usando uma seringa de um mililitro através do cateter. Utilizar micropinça Dumont, microagulha Castroviejo e sutura 4-0 para colocar um ponto abaixo da ramificação da veia porta e um segundo ponto um centímetro abaixo para fixar o cateter.Conecte o cateter a um tubo de silicone de um metro de comprimento, três milímetros de diâmetro interno e 4,1 milímetros de diâmetro externo com um conector de isca. Conecte a tubulação de silicone a uma bomba peristáltica e a um reservatório contendo água deionizada. Remova cuidadosamente as bolhas de ar dentro do tubo e evite gerar novas bolhas durante a perfusão.Ajuste a bomba peristáltica a uma saída de fluxo de 0,2 mililitros por minuto. Examine primeiro com água deionizada por duas horas e a cor do fígado mudará de vermelho para amarelo durante a perfusão. Troque a solução de perfusão para desoxicolato de sódio a 0,5% e continue durante a noite e o fígado ficará branco no final da perfusão.Troque a solução de perfusão por água deionizada e perfunda por duas horas. Use micropinças Dumont e tesouras de mola micro para coletar o fígado descelularizado e lavá-lo cuidadosamente em uma placa de Petri com PBS. Transfira um pequeno pedaço de fígado descelularizado para uma lâmina de microscópio e coloque o tecido no meio.Adicione 10 microlitros de meio de montagem antifade ao tecido com uma pipeta para evitar o ressecamento do tecido. Cubra o tecido com um vidro de cobertura e aplique uma pequena força para achatar a amostra. Sele as bordas do vidro da tampa com esmalte incolor e transparente.Coloque uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio. Abaixe a lente objetiva de óleo 20X até entrar em contato com o óleo de imersão. Mude para o canal violeta de comprimento de onda de 405 nanômetros.Ligue o obturador e concentre a amostra. Navegue e posicione a área de interesse para geração de imagens. Desligue o obturador antes de passar para a aquisição de imagens usando luz laser.Para iniciar o laser de dois fótons, alterne para o controle do computador e ligue o laser de dois fótons primeiro. Em seguida, ligue o controlador de laser de dois fótons e o obturador, garantindo que a potência de saída seja superior a 2,5 watts. Reduza a potência do laser para evitar a têmpera da fluorescência.Selecione e ajuste os detectores, tanto os multiplicadores de fotos quanto o híbrido para acomodar os fluoróforos escolhidos. Escolha aquisições de imagens simultâneas ou sequenciais. Ajuste o orifício para o valor mais alto.Ajuste os comprimentos de onda do laser, ganho, potência, deslocamento do tempo de permanência do pixel, média do tamanho do pixel e zoom. Role o controlador Z do computador e defina as dimensões Z. Defina os pontos de início e fim e escolha os números de imagens fornecidos dentro de um volume.Adquirir imagens. Após a realização da microscopia dos dois fótons, as fibras colágenas sem descelularização revelaram uma imagem de baixa resolução da rede colágena. Na matriz extracelular decelularizada, diferenças aparentes foram observadas na morfologia e distribuição espacial entre fígados de ração e dieta fast food.Fibras colágenas e camundongos em dieta com ração exibiram uma rede entrelaçada e bem organizada, enquanto os camundongos em dieta fast food apresentaram feixes de colágeno com menor conectividade. A estrutura tridimensional da matriz extracelular hepática mostra que as fibras colágenas em camundongos na dieta chow mostraram uma rede bem organizada, mas não em camundongos dieta fast food. Para confirmar a qualidade do colágeno fibrilar na matriz extracelular decelularizada, as lâminas foram coradas com Hematoxilina Eosina e Picrosirius red.A hematoxilina e a eosina mostram que todas as células foram removidas. Nas imagens de coloração vermelha do Picrosirius, a matriz extracelular dos camundongos alimentados com ração revelou uma rede bem organizada. E, em contraste, camundongos em dieta de fast food mostraram fibras de colágeno mais densas.Remova cuidadosamente a bolha dentro de um tubo antes da perfusão. A bolha bloqueará o vaso no fígado e afetará a perfusão.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

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