Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
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Agradecemos a Hyesuk Park por la ayuda técnica. Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Agradecemos a Jon Mulholland y Kitty Lee del Centro de Imágenes de Ciencias Celulares en el Centro Beckman por su asistencia técnica con las imágenes de microscopía de dos fotones.

Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con los procedimientos experimentales aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Stanford y el Hospital de Asuntos de Veteranos en Palo Alto. Los ratones machos C57BL / 6J de 6-8 semanas de edad fueron alimentados con comida rápida o una dieta de comida rápida suplementada con jarabe de maíz con alto contenido de fructosa al 4,2% (consulte la Tabla de materiales) en agua potable durante 14 se...

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S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

El presente protocolo muestra que la descelularización a través de una perfusión in situ DOC de bajo caudal preserva las estructuras frangibles de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas, proporcionando una plataforma confiable y rentable para capturar la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática NASH. Aunque la descelularización se realizó en hígados normales y fibróticos antes de identificar componentes de la MCE o generar andamios biológicos para cultivo celular, la dinámica d...

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la enfermedad hepática más común, que afecta al 20% -25% de la población adulta. El 25% de los pacientes con NAFLD progresan a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), donde el riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular aumenta1. En los próximos 20 años, se estima que NASH representará 2 millones de muertes relacionadas con el hígado en EE.UU.2. Como no existen tratamientos aprobados, existe una necesidad urgente de descifrar los mecanismos que causan fibrosis hepática en pacientes con EHNA y desarrollar un tratamiento dirigido3.
La matriz extracelular (MEC) es un microambiente dinámico y complejo que ejerce comunicación bidireccional con las células para regular la homeostasis tisular4. La ECM hepática está compuesta por elementos estructurales como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina y otras proteínas no estructurales (por ejemplo, olfactomedina y trombospondina) para proporcionar soporte físico y estructural4.
La fibrosis hepática es una respuesta crónica de cicatrización de heridas al daño hepático de diversas etiologías, incluida la EHNA3. Es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la matriz ECM y se caracteriza por un exceso de proteínas estructurales en el hígado lesionado4. La fibrogénesis depende de la comunicación dinámica célula-célula entre los diferentes tipos de células hepáticas. Las células estrelladas hepáticas (HSC), cuando se activan, se diferencian en células similares a miofibroblastos que expresan actina, migran y proliferan en músculo liso alfa 2 y sintetizan proteínas ECM como una acción de cierre de heridas. Las HSC activadas son las células productoras de colágeno central en el hígado1.
El mecanismo molecular de la remodelación de la ECM, los patrones de fibrosis y su relación con los eventos celulares no están claros. Todavía se necesita una mejor comprensión de la estructura tridimensional (3D) de la ECM, a pesar de que las técnicas de espectrometría de masas han ayudado a analizar la composición de la proteína ECM4. Tradicionalmente, la tinción tricrómica de Masson, las tinciones de rojo Picro Sirius y las imágenes de segunda generación armónica (SHG) se han realizado en secciones delgadas del hígado bidimensionales (2D). El patrón típico de fibrosis de NASH se llama "alambre de gallina", que se extiende a la zona 3 y es fibrosis perisinusoidal/pericelular 5,6. Sin embargo, ha habido una falta de estudios centrados en la estructura 3D del hígado nativo, particularmente aquellos que no implican la sección de tejido. Los enfoques de imagen robustos para identificar patrones y características de la fibrosis a través de la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática fortalecerían significativamente la comprensión de los mecanismos de NASH e identificarían nuevos objetivos terapéuticos.
Para abordar estos desafíos, se optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la ECM hepática nativa a través de la descelularización7. La descelularización de todo el hígado es un enfoque para eliminar el contenido celular hepático mientras se mantiene la red 3D ECM nativa a través de la perfusión detergente. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida (FFD) durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión in situ de la vena porta con detergente suave y bajas tasas de flujo para preservar las estructuras de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. Se aplicó microscopía de dos fotones para analizar los cambios en las estructuras de colágeno en la ECM. Se reconstituyeron y analizaron las imágenes 3D de la estructura nativa de ECM en hígados normales y NASH. Realizar la descelularización de perfusión in situ y analizar el andamio mediante microscopía de dos fotones proporciona una plataforma práctica y asequible para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es la enfermedad hepática crónica más común en los Estados Unidos, que afecta a más de 70 millones de estadounidenses. NASH puede progresar a fibrosis y, finalmente, a cirrosis, un factor de riesgo significativo para el carcinoma hepatocelular. La matriz extracelular (ECM) proporciona soporte estructural y mantiene la homeostasis hepática a través de señales matricelulares. La fibrosis hepática es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la ECM y se caracteriza por una acumulación excesiva de elementos estructurales y cambios asociados en los glicosaminoglicanos. El patrón de fibrosis típico de NASH se llama "alambre de pollo", que generalmente consiste en fibrosis perisinusoidal/pericelular de zona 3, según las características observadas por la tinción tricrómica de Masson y las tinciones de rojo de Picrosirius. Sin embargo, estas técnicas tradicionales de imágenes bidimensionales delgadas (2D) basadas en diapositivas de tejido no pueden demostrar los cambios estructurales detallados de ECM tridimensional (3D), lo que limita la comprensión de la remodelación dinámica de ECM en la fibrosis hepática.
El trabajo actual optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la estructura nativa de ECM en el hígado a través de la descelularización para abordar los desafíos anteriores. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión de la vena porta in situ , y las técnicas de microscopía de dos fotones se aplicaron para obtener imágenes y analizar los cambios en la ECM nativa. Las imágenes 3D de los hígados normal y NASH fueron reconstituidas y analizadas. La realización de la descelularización de perfusión in situ y el análisis del andamio mediante microscopía de dos fotones proporcionaron una plataforma práctica y confiable para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.

Las fibras de colágeno se detectaron con segunda generación armónica y microscopía de dos fotones. La señal proviene de las estructuras frangibles de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. No se utilizaron anticuerpos específicos para analizar los subtipos de colágeno; Sin embargo, esto podría agregarse a la técnica de imagen.
Cuando se estudia el tejido hepático sin descelularización, es difícil obtener imágenes de alta resolución de la red de colágeno (<strong...

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3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH es una de las enfermedades hepáticas crónicas más importantes del mundo. Puede progresar a fibrosis, cirrosis y, finalmente, cáncer de hígado. Estudiar el cambio dinámico de la ECM en la EHNA puede ayudar a comprender mejor la fibrosis.Las imágenes tradicionales no pueden demostrar cambios en la estructura de la ECM 3D, lo que limita la comprensión del proceso de remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática. Para comenzar, pese el ratón antes del procedimiento. Después de anestesiar al ratón, afeite el área ventral con un cortapelos y desinfecte la piel con etanol al 70%.Coloque el ratón sobre su espalda e inmovilice las patas en la placa quirúrgica con cinta adhesiva. Use tijeras Mayo y fórceps Adson para hacer una incisión de tres centímetros lateralmente en la parte inferior del abdomen. Y luego una incisión de cinco centímetros verticalmente desde la parte baja del abdomen hasta el proceso xifoide sin abrir la cavidad torácica.Después de abrir el peritoneo, coloque suavemente los intestinos a la izquierda del animal y eleve el lóbulo derecho del hígado con un aplicador con punta de rayón para exponer la vena porta. Para cateterizar la vena porta, inducir un catéter IV de calibre 24 en el extremo distal de la vena porta. Coloque la punta del catéter antes de que la vena porta se ramifique hacia los lóbulos hepáticos.Extraiga la aguja inmediatamente cuando el catéter entre en la vena. Verifique que el catéter esté colocado correctamente dentro de la vena perfundiendo el hígado con PBS usando una jeringa de un mililitro a través del catéter. Use microfórceps Dumont, una microaguja Castroviejo y sutura 4-0 para colocar una sutura debajo de la ramificación de la vena porta y una segunda puntada un centímetro más abajo para asegurar el catéter.Conecte el catéter a un tubo de silicona de un metro de longitud, tres milímetros de diámetro interior y 4,1 milímetros de diámetro exterior con un conector de señuelo. Conecte el tubo de silicona a una bomba peristáltica y a un depósito que contenga agua desionizada. Retire con cuidado las burbujas de aire dentro del tubo y evite generar nuevas burbujas durante la perfusión.Ajuste la bomba peristáltica a una salida de flujo de 0,2 mililitros por minuto. Examine primero con agua desionizada durante dos horas y el color del hígado cambiará de rojo a amarillo durante la perfusión. Cambie la solución de perfusión a desoxicolato de sodio al 0,5% y continúe durante la noche y el hígado se volverá blanco al final de la perfusión.Cambie la solución de perfusión a agua desionizada y perfunda durante dos horas. Use microfórceps Dumont y tijeras de resorte micros para recoger el hígado descelularizado y lavarlo cuidadosamente en una placa de Petri con PBS. Transfiera una pequeña pieza de hígado descelularizado a un portaobjetos de microscopio y coloque el tejido en el medio.Agregue 10 microlitros de medio de montaje antidecoloración al tejido con una pipeta para evitar que el tejido se seque. Cubra el pañuelo con un vaso de cobertura y aplique una pequeña fuerza para aplanar la muestra. Selle los bordes del vidrio de la cubierta con esmalte de uñas incoloro y transparente.Coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio. Baje la lente del objetivo de aceite 20X hasta que entre en contacto con el aceite de inmersión. Cambie al canal violeta de longitud de onda 405 nanómetros.Encienda el obturador y enfoque la muestra. Navegue y posicione el área de interés para la obtención de imágenes. Apague el obturador antes de pasar a la adquisición de imágenes mediante luz láser.Para iniciar el láser de dos fotones, cambie al control de la computadora y encienda primero el láser de dos fotones. Luego encienda el controlador láser de dos fotones y el obturador asegurándose de que la potencia de salida sea superior a 2,5 vatios. Reduzca la potencia del láser para evitar el enfriamiento de la fluorescencia.Seleccione y ajuste los detectores tanto de fotomultiplicadores como del híbrido para acomodar los fluoróforos elegidos. Elija adquisiciones de imágenes simultáneas o secuenciales. Ajuste el agujero de alfiler al valor más alto.Ajuste las longitudes de onda del láser, la ganancia, la potencia, el desplazamiento del tiempo de permanencia de píxeles, el promedio de tamaño de píxel y el zoom. Desplácese por el controlador Z del ordenador y establezca las dimensiones Z. Defina los puntos inicial y final y elija el número de imágenes proporcionadas dentro de un volumen.Adquirir imágenes. Después de realizar la microscopía de dos fotones, las fibras de colágeno sin descelularización revelaron una imagen de baja resolución de la red de colágeno. En la matriz extracelular descelularizada, se observaron diferencias aparentes en la morfología y distribución espacial entre los hígados de comida rápida y comida rápida.Las fibras de colágeno y los ratones en una dieta de comida exhibieron una red entrelazada y bien organizada, mientras que los ratones en la dieta de comida rápida mostraron paquetes de colágeno con menos conectividad. La estructura tridimensional de la matriz extracelular del hígado muestra que las fibras de colágeno en ratones en la dieta chow mostraron una red bien organizada, pero no en ratones de dieta de comida rápida. Para confirmar la calidad del colágeno fibrilar en la matriz extracelular descelularizada, los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina eosina y rojo Picrosirius.La hematoxilina y la eosina muestran que todas las células han sido eliminadas. En las imágenes de tinción roja de Picrosirius, la matriz extracelular de los ratones alimentados con chow reveló una red bien organizada. Y en contraste, los ratones con dieta de comida rápida mostraron fibras de colágeno más densas.Retire con cuidado la burbuja dentro de un tubo antes de la perfusión. La burbuja bloqueará el vaso en el hígado y afectará la perfusión.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

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Investigación

Medicina

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

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Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

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Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

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Tratamiento farmacológico mediante catéter venoso central en un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal inducido por angiotensina II y monitorización por ecografía 3D

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

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Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

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