Name: 3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

Teknik yardım için Hyesuk Park'a teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, NJT'ye), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA), NIH (1R01AG060726, NJT'ye) tarafından finanse edilmiştir. Beckman Merkezi'ndeki Hücre Bilimleri Görüntüleme Tesisi'nden Jon Mulholland ve Kitty Lee'ye iki fotonlu mikroskopi görüntüleme ile ilgili teknik yardım için minnettarız.

Hayvan deneyleri, Stanford Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım komiteleri (IACUC'ler) ve Palo Alto'daki Gazi İşleri Hastanesi tarafından onaylanan deneysel prosedürlere göre gerçekleştirilir. 6-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri, 14 hafta boyunca içme suyunda% 4.2 yüksek fruktozlu mısır şurubu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş bir chow veya fast-food diyeti ile beslendi5. Fareler 12 saatlik bir karanlık / aydınlık döngüsünde st...

<ol>
	<li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis:+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future.">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li><li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence,+incidence,+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li><li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis.">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li><li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens.">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).</li><li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging.">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li><li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes.">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li><li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D.">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition.">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83 (2019).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue.">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398 (2016).</li><li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices.">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li><li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+cancer:+A+strained+relationship.">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).</li><li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrix+in+cancer.">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li><li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment.">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li><li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation.">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079 (2015).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+(C3A)+function+and+polarity.">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).</li><li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy.">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).</li></ol>

Mevcut protokol, düşük akış hızına sahip DOC in situ perfüzyon yoluyla desellülarizasyonun, NASH karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesini yakalamak için güvenilir ve uygun maliyetli bir platform sağlayarak, kırılabilir üçlü sarmal ve doğal fibriller kollajen yapılarını koruduğunu göstermektedir. ECM bileşenlerini tanımlamadan veya hücre kültürü için biyolojik iskeleler oluşturmadan önce normal ve fibrotik karaciğerlerde desellülarizasyon yapılmasına rağmen,...

Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), yetişkin popülasyonun% 20-25'ini etkileyen en yaygın karaciğer hastalığıdır. NAFLD hastalarının% 25'i siroz, karaciğer yetmezliği ve hepatosellüler karsinom riskinin arttığı alkolsüz steatohepatite (NASH) ilerler1. Önümüzdeki 20 yıl içinde, NASH'ın ABD 2'de2 milyon karaciğere bağlı ölümden sorumlu olacağı tahmin edilmektedir. Onaylanmış tedavileri olmadığından, NASH hastalarında karaciğer fibrozuna neden olan mekanizmaların deşifre edilmesine ve hedefe yönelik tedavinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır3.
Hücre dışı matriks (ECM), doku homeostazını düzenlemek için hücrelerle çift yönlü iletişim kuran dinamik, karmaşık bir mikro ortamdır4. Karaciğer ECM, fiziksel ve yapısal destek sağlamak için proteoglikanlar, kollajenler, fibronektin, elastin ve diğer yapısal olmayan proteinler (örneğin, olfaktomedin ve trombozpondin) gibi yapısal elemanlardan oluşur4.
Karaciğer fibrozisi, NASH3 dahil olmak üzere çeşitli etiyolojilerin karaciğer hasarına karşı kronik yara iyileşmesi yanıtıdır. Dinamik ECM matriks yeniden şekillendirme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yaralı karaciğerde aşırı yapısal proteinler ile karakterizedir4. Fibrogenez, farklı hepatik hücre tipleri arasındaki dinamik hücre-hücre iletişimine bağlıdır. Hepatik yıldız hücreleri (HSC'ler), aktive edildiğinde, Düz Kas Alfa 2 Aktin eksprese eden, göç eden ve çoğalan miyofibroblast benzeri hücrelere farklılaşır ve ECM proteinlerini yara kapatma eylemi olarak sentezler. Aktive HSC'ler karaciğerdeki merkezi kollajen üreten hücrelerdir1.
ECM yeniden şekillenmesinin moleküler mekanizması, fibrozis paternleri ve hücresel olaylarla ilişkisi açık değildir. Kütle spektrometresi teknikleri ECM protein bileşimi4'ün analiz edilmesine yardımcı olsa da, üç boyutlu (3D) ECM yapısının daha iyi anlaşılması hala gereklidir. Geleneksel olarak, Masson'un trikrom boyası, Picro Sirius Kırmızı lekeleri ve ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme iki boyutlu (2D) ince karaciğer kesitlerinde gerçekleştirilmiştir. NASH'ın tipik fibroz paterni, bölge 3'e uzanan ve perisinüzoidal / perisellüler fibroz 5,6 olan "tavuk teli" olarak adlandırılır. Bununla birlikte, doğal karaciğerin 3D yapısına, özellikle de doku bölümlemesini içermeyenlere odaklanan çalışmaların eksikliği olmuştur. Karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesi sırasında fibrozisin paternlerini ve özelliklerini tanımlamak için sağlam görüntüleme yaklaşımları, NASH mekanizmalarının anlaşılmasını ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesini önemli ölçüde güçlendirecektir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, doğal karaciğer ECM'sini hücre desellülarizasyonu yoluyla görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokol optimize edilmiştir7. Tüm karaciğer desellülarizasyonu, deterjan perfüzyonu yoluyla doğal 3D ECM ağını korurken hepatik hücresel içeriği uzaklaştırmak için bir yaklaşımdır. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti (FFD) ile beslendi. Üçlü helisel ve doğal fibriller kollajen yapılarını korumak için hafif deterjan ve düşük akış hızı ile in situ portal ven perfüzyonu sonrası desellülarizasyon yapıldı. ECM'de kollajen yapılarındaki değişiklikleri analiz etmek için iki foton mikroskobu uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerindeki doğal ECM yapısının 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve uygun fiyatlı bir platform sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18&#34; P-3</td>
			<td>MONOCRYL</td>
			<td>Y494G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 suture</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>10-000-649</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed Injection (xylazine)</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>NDC 59399-110-20</td>
			<td>this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY</td>
			<td>BD</td>
			<td>382612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chow diet</td>
			<td>Envigo</td>
			<td># 2918</td>
			<td>Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-food diet (AIN76A Western Diet)</td>
			<td>Test Diet</td>
			<td>1810060</td>
			<td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-3502</td>
			<td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kent Scientific Rat Surgical Kit</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-005-205</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.</td>
			<td>KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK&#174;)</td>
			<td>bbraun</td>
			<td>D300</td>
			<td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Stain Kit</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>24901</td>
			<td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rayon tipped applicator</td>
			<td>puritan</td>
			<td>25-806 1PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>sigmaaldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrup</td>
			<td>www.target.com</td>
			<td>24 fl oz</td>
			<td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Peristaltic Pump</td>
			<td>INTLLAB</td>
			<td>BT100</td>
			<td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>vectorlabs</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d imaging of the liver extracellular matrix in a mouse model of non-alcoholic steatohepatitis

Alkolsüz steatohepatit (NASH), Amerika Birleşik Devletleri'nde 70 milyondan fazla Amerikalıyı etkileyen en yaygın kronik karaciğer hastalığıdır. NASH, fibrozise ve nihayetinde hepatosellüler karsinom için önemli bir risk faktörü olan siroza ilerleyebilir. Hücre dışı matriks (ECM) yapısal destek sağlar ve matrisellüler sinyaller yoluyla karaciğer homeostazını korur. Karaciğer fibrozisi, dinamik ECM yeniden şekillenme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yapısal elementlerin aşırı birikimi ve glikozaminoglikanlarda ilişkili değişiklikler ile karakterizedir. NASH'ın tipik fibroz paterni, Masson'un trikrom boyası ve Picrosirius Kırmızı lekeleri tarafından gözlemlenen özelliklere dayanarak, genellikle bölge 3 perisinüzoidal / perisellüler fibrozdan oluşan "tavuk teli" olarak adlandırılır. Bununla birlikte, bu geleneksel ince iki boyutlu (2D) doku slaytına dayalı görüntüleme teknikleri, ayrıntılı üç boyutlu (3D) ECM yapısal değişikliklerini gösteremez ve karaciğer fibrozunda dinamik ECM yeniden şekillenmesinin anlaşılmasını sınırlar.
Mevcut çalışma, yukarıdaki zorlukları ele almak için desellülarizasyon yoluyla karaciğerdeki doğal ECM yapısını görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokolü optimize etti. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti ile beslendi. Desellülarizasyon in situ portal ven perfüzyonundan sonra yapıldı ve iki fotonlu mikroskopi teknikleri doğal ECM'deki değişiklikleri görüntülemek ve analiz etmek için uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerinin 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve güvenilir bir platform sağlamıştır.

Kollajen lifleri ikinci harmonik jenerasyon ve iki foton mikroskobu ile tespit edildi. Sinyal, kırılabilir üçlü sarmal ve doğal fibriller kollajen yapılarından gelir. Kollajen alt tiplerini analiz etmek için spesifik antikorlar kullanılmadı; Bununla birlikte, bu görüntüleme tekniğine eklenebilir.
Karaciğer dokusu desellülarizasyon olmadan incelendiğinde, kollajen ağının yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek zordur (Şekil 5A</s...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis at JoVE.com

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Mevcut protokol, alkolsüz steatohepatit (NASH) sırasında hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesinin dinamiklerini görselleştirmek için güvenilir bir platform oluşturmak üzere karaciğer in situ perfüzyon / desellülarizasyon ve iki foton mikroskopi yöntemlerini optimize etmektedir.

Alkolsüz Steatohepatitin Bir Fare Modelinde Karaciğer Hücre Dışı Matriksin 3D Görüntülenmesi

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH dünyadaki en önemli kronik karaciğer hastalıklarından biridir. Fibroz, siroz ve sonunda karaciğer kanserine ilerleyebilir. NASH'daki ECM'nin dinamik değişimini incelemek, fibrozisi daha iyi anlamaya yardımcı olabilir.Geleneksel görüntüleme yöntemi, karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenme sürecinin anlaşılmasını sınırlayan 3D ECM yapı değişikliklerini gösteremez. Başlamak için, işlemden önce fareyi tartın. Anestezi uyguladıktan sonra, fare ventral bölgeyi bir saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin ve cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin.Fareyi sırtına yerleştirin ve ameliyat tahtasındaki bacakları bantla hareketsiz hale getirin. Alt karın bölgesinde lateral olarak üç santimetrelik bir kesi yapmak için Mayo makası ve Adson forseps kullanın. Ve sonra göğüs boşluğunu açmadan alt karından ksifoid sürece dikey olarak beş santimetrelik bir kesi.Peritonu açtıktan sonra, bağırsakları yavaşça hayvanın soluna yerleştirin ve portal damarı açığa çıkarmak için karaciğerin sağ lobunu bir rayon uçlu aplikatör ile yükseltin. Portal veni kateterize etmek için, portal venin distal ucuna 24 gauge IV kateter indükleyin. Kateter ucunu portal ven dalları hepatik loblara dallanmadan önce yerleştirin.Kateter damara girdiğinde iğneyi hemen çekin. Kateter yoluyla bir mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğeri PBS ile perfüze ederek kateterin damar içine doğru şekilde yerleştirildiğini kontrol edin. Portal venin dallanmasının altına bir dikiş ve kateteri sabitlemek için bir santimetre aşağıya ikinci bir dikiş yerleştirmek için Dumont mikro forseps, bir Castroviejo mikro iğnesi ve 4-0 sütür kullanın.Kateteri bir metre uzunluğunda, üç milimetre iç çapa ve 4,1 milimetre dış çapa sahip bir silikon boruya bir cazibe konektörü ile bağlayın. Silikon boruyu peristaltik bir pompaya ve deiyonize su içeren bir rezervuara bağlayın. Tüpün içindeki hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın ve perfüzyon sırasında yeni kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.Peristaltik pompayı dakikada 0,2 mililitre akış çıkışına ayarlayın. İlk önce iki saat boyunca deiyonize su ile inceleyin ve karaciğerin rengi perfüzyon sırasında kırmızıdan sarıya değişecektir. Perfüzyon çözeltisini% 0.5 sodyum deoksikolata değiştirin ve gece boyunca devam edin ve karaciğer perfüzyonun sonunda beyazlaşacaktır.Perfüzyon çözeltisini deiyonize suya geçirin ve iki saat boyunca perfüze edin. Hücreden arındırılmış karaciğeri toplamak için Dumont mikro forseps ve mikro yaylı makas kullanın ve PBS ile bir Petri kabında dikkatlice yıkayın. Küçük bir desellülarize karaciğer parçasını mikroskop slaytına aktarın ve dokuyu ortasına yerleştirin.Dokunun kurumasını önlemek için pipetle dokuya 10 mikrolitre antifade montaj ortamı ekleyin. Dokuyu bir kapak camıyla örtün ve numuneyi düzleştirmek için küçük bir kuvvet uygulayın. Kapak camının kenarlarını renksiz ve şeffaf oje ile kapatın.Kapak camının üstüne bir damla daldırma yağı yerleştirin ve slaytı mikroskop slayt tutucusuna yerleştirin. 20X yağ objektif lensini, daldırma yağına temas edene kadar indirin. 405 nanometre dalga boyundaki mor kanala geçin.Deklanşörü açın ve örneğe odaklanın. Görüntüleme için ilgi alanında gezinin ve konumlandırın. Lazer ışığını kullanarak görüntü yakalamaya geçmeden önce deklanşörü kapatın.İki foton lazeri başlatmak için, bilgisayar kontrolüne geçin ve önce iki foton lazeri açın. Ardından, çıkış gücünün 2,5 watt'tan yüksek olmasını sağlamak için iki foton lazer kontrol cihazını ve deklanşörü açın. Floresan söndürmeyi önlemek için lazer gücünü azaltın.Seçilen floroforları barındırmak için hem fotoğraf çarpanlarını hem de hibrid dedektörleri seçin ve ayarlayın. Eşzamanlı veya sıralı görüntü alımlarını seçin. İğne deliğini en yüksek değere ayarlayın.Lazer dalga boylarını, kazancı, gücü ayarlayın, piksel bekleme süresini, piksel boyutu ortalamasını ve yakınlaştırmayı ayarlayın. Bilgisayar Z denetleyicisini kaydırın ve Z boyutlarını ayarlayın. Başlangıç ve uç noktaları tanımlayın ve bir birim içinde verilen görüntü sayısını seçin.Görüntüleri alın. İki foton mikroskobu yapıldıktan sonra, desellülarizasyon olmadan kollajen lifleri, kollajen ağının düşük çözünürlüklü bir görüntüsünü ortaya çıkardı. Desellülarize hücre dışı matrikste, chow ve fast food diyet karaciğerleri arasındaki morfoloji ve mekansal dağılımda belirgin farklılıklar gözlendi.Bir chow diyetindeki kollajen lifleri ve fareler iç içe geçmiş ve iyi organize edilmiş bir ağ sergilerken, fast food diyetindeki fareler daha az bağlantıya sahip kollajen demetleri gösterdi. Karaciğer hücre dışı matrisinin üç boyutlu yapısı, chow diyetindeki farelerdeki kollajen liflerinin iyi organize edilmiş bir ağ gösterdiğini, ancak fast food diyet farelerinde olmadığını göstermektedir. Desellülarize hücre dışı matriksteki fibriller kollajenin kalitesini doğrulamak için, slaytlar Hematoksilin Eozin ve Picrosirius kırmızısı ile boyandı.Hematoksilin ve Eozin tüm hücrelerin çıkarıldığını göstermektedir. Picrosirius kırmızı boyama görüntülerinde, chow beslenen farelerden gelen hücre dışı matris, iyi organize edilmiş bir ağ ortaya çıkardı. Buna karşılık, fast food diyetindeki fareler daha yoğun kollajen lifleri gösterdi.Perfüzyondan önce bir tüpün içindeki kabarcığı dikkatlice çıkarın. Kabarcık karaciğerdeki damarı tıkayacak ve perfüzyonu etkileyecektir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Stratejik Endotel Hücre Tüp Oluşumu Testi: Azaltılmış Ekstrasellüler Matrix Ekstrasellüler Matrix ve Büyüme Faktörü Karşılaştırılması

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis NASH Resolution

-Alkolsüz Steatohepatitis (NASH) çözünürlük değerlendirmek farelerde hayatta kalınabilir karaciğer biyopsisi yordam eklenmesi

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

Anjiyotensin II İndüklü Abdominal Aort Anevrizmasının Bir Fare Modelinde Santral Venöz Kateter ile İlaç Tedavisi ve 3D Ultrason ile İzleme

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

Palmitik Asit Kaynaklı In Vitro Modelde Platycodin D'nin Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığı Üzerindeki Koruyucu Etkilerinin İncelenmesi

The occurrence of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has been increasing at an alarming rate worldwide. Platycodon grandiflorum is widely used as a ...

Delivery of Cardioactive Therapeutics in a Porcine Myocardial Infarction Model

Domuz Miyokard Enfarktüsü Modelinde Kardiyoaktif Terapötiklerin Verilmesi

Myocardial infarction is one of the leading causes of death and disability worldwide, and there is an urgent need for novel cardioprotective or ...

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

Enhancing Transplantation Research Through MicroCT Angiography in Murine Models (Video) | JoVE

Mikrobilgisayarlı Tomografi Anjiyografi Kullanan Farelerde Başarılı Ortotopik Karaciğer Nakli

Microcomputed tomography (microCT) angiography is an invaluable resource to researchers. New advances in this technology have allowed for high-quality ...