Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

أصبحت البروتوكولات الواردة في هذه المخطوطة ممكنة بفضل المساهمات المتراكمة للزملاء السابقين في مختبر الدكتور وارن زابول لأبحاث التخدير في الرعاية الحرجة ، قسم التخدير في مستشفى ماساتشوستس العام. ونعرب عن تقديرنا لمساهمة الدكاترة أكيتو ناكاغاوا، وفرانشيسكو زاديك، وإيمانويل فاسينا، وتشونغ لي، وياسوكو ناغاساكا، وإستر سباغنولي، وإيمانويل ريزواغلي.

الإجراءات المشار إليها في هذا البروتوكول هي وفقا لمجلس مراجعة مستشفى ماساتشوستس العام. تم جمع عينات الدم التي تم استخدامها خلال دراسة سابقة وتم إلغاء تحديدها للغرض الحالي18.
ملاحظة: راجع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على إرشادات محددة بشأن التوصيلات المثلى بي?...

نظرا للحساسية العالية ، فإن الفحوصات القائمة على التلألؤ الكيميائي لتحديد NO والمركبات ذات الصلة لديها خطر كبير من تلوث NO 2. يجب اختبار كل كاشف (خاصة محلول الحجب NO 2) والمخفف (بما في ذلك ddH 2 O) المستخدم في التجربة لمحتواه NO 2- لتصحيحه لإشارة الخلفية. الن?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

نشاط أكسيد النيتريك (NO) في الجسم الحي هو النتائج المشتركة لآثاره المباشرة ، وعمل مشتقاته الناتجة عن عدم autoxidation ، وتأثيرات المركبات النيتروجينية. يعد قياس مستقلبات NO ضروريا لدراسة نشاط NO على مستوى الأوعية الدموية وفي الأنسجة الأخرى ، خاصة في الإعدادات التجريبية حيث يتم إعطاء NO الخارجي. تسمح اختبارات التلألؤ الكيميائي القائمة على الأوزون بإجراء قياسات دقيقة للمستقلبات NO و NO في كل من السوائل (بما في ذلك البلازما ، ومتجانسات الأنسجة ، ومزارع الخلايا) ومخاليط الغاز (على سبيل المثال ، التنفس الزفير). لا يتفاعل مع الأوزون لتوليد ثاني أكسيد النيتروجين في حالة مثيرة. يسمح انبعاث الضوء الناتج عن ذلك بالكشف الضوئي وتوليد إشارة كهربائية تعكس محتوى NO للعينة. يمكن استخدام Aliquots من نفس العينة لقياس مستقلبات NO محددة ، مثل النترات والنتريت و S-nitrosothiols ومجمعات الحديد والنيتروزيل. بالإضافة إلى ذلك ، لا يستهلك الهيموغلوبين الخالي من الخلايا أيضا كميا مع تحليل التلألؤ الكيميائي. يتم توفير مثال توضيحي لجميع هذه التقنيات.

واستخدم اختبار عدم الاستهلاك بواسطة مقايسة Hb الخالية من الخلايا في عينات تحتوي على تركيزات معروفة من أوكسي Hb الخالي من الخلايا (الشكل 4). نظرا لأن هيم واحد من oxyHb يطلق جزيء NO واحد في الفحص ، يتم استخدام oxyHb الخالي من الخلايا المنقى لبناء منحنى المعايرة للفحص (الشكل التكمي...

Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

هنا ، نقدم بروتوكولات للكشف عن أكسيد النيتريك ومشتقاته ذات الصلة بيولوجيا باستخدام الفحوصات القائمة على التلألؤ الكيميائي بحساسية عالية.

المقايسات القائمة على التلألؤ الكيميائي للكشف عن أكسيد النيتريك ومشتقاته من الأتمتة ومركبات النيتروجين

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

يمكن هذا البروتوكول الباحثين من استخدام كاشف التلألؤ الكيميائي ببراعة لقياس مستقلبات أكسيد النيتريك دون توجيه أو تكلفة توظيف موظفين متخصصين في الموقع. الفحص القائم على التلألؤ الكيميائي هو الطريقة الأكثر حساسية للكشف عن الحد الأدنى من التغيرات في مستويات أكسيد النيتريك ومستقلباته في أي عينة بيولوجية معينة. أكسيد النيتريك المستنشق هو غاز علاجي يستخدم لمجموعة واسعة من الأمراض.من الأهمية بمكان أن يرتبط تطور المرض والتعافي منه ارتباطا دقيقا بمستويات مستقلب أكسيد النيتريك. أكسيد النيتريك المستنشق ، وهو مضاد للميكروبات ، يظهر وعدا في علاج المرضى الذين يعانون من الأمراض المعدية في مجرى الهواء. توفر طريقة التلألؤ الكيميائي نظرة ثاقبة على جرعة أكسيد النيتريك المرتبطة ومستقلباته مع التغيرات الميكروبيولوجية والفيزيولوجية المرضية.لتحضير محلول DETA-NONOate ، أضف 10 ملليغرام من DETA-NONOate إلى 610 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 10 ملليمولار في PBS من الرقم الهيدروجيني 7.4 لتوليد 100 ملليمول من DETA-NONOate وإبقائه على الجليد. للمتابعة ، قم بتوصيل خط الأكسجين بكاشف التلألؤ الكيميائي وافتح خزان الأكسجين عند الضغط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة الواردة في النص. ثم قم بتوصيل خط المرشح العازل للمجال المكثف بكاشف التلألؤ الكيميائي.على واجهة كاشف التلألؤ الكيميائي ، ابدأ في تشغيل برنامج الكشف عن فحوصات الطور السائل ، مما يضمن أن إمدادات الأكسجين كافية وسيبدأ الكاشف في أخذ العينات ، مما يشير إلى الكشف عن طريق الإشارة بالمللي فولت ، وإلا ستدفع بإشارة تشخيصية سلبية. لإعداد وعاء التطهير ، أغلق وعاء التطهير في جميع الموانئ الثلاثة عن طريق شد صمام الإبرة بالكامل إلى اليمين وإغلاق ديوك إيقاف المدخل والمخرج. قم بإزالة الغطاء من وعاء التطهير.أضف كمية كافية من الكاشف الخاص بالفحص المخطط له إلى غرفة التفاعل بحيث يمكن لإبرة المحقنة المستخدمة في حقن العينات الوصول إلى عمود السائل مع التحقق من وجود خط أساس مستقر ومرغوب فيه. لبدء تدفق غاز التطهير ، تأكد من أن خزان الغاز الخامل مجهز بمنظم من مرحلتين ، وقم بتوصيل خزان الغاز الخامل بمدخل الغاز في السفينة. ثم افتح مخرج وعاء التطهير وافتح الغاز بضغط مخرج عند المنظم من واحد إلى خمسة أرطال لكل بوصة مربعة.بعد ذلك ، افتح مدخل وعاء التطهير وافتح ببطء صمام الإبرة لوعاء التطهير للسماح بتدفق الغاز والتحقق من الفقاعات داخل وعاء التطهير. لضبط تدفق الغاز، سجل ضغط الخلية الذي تم قياسه بواسطة كاشف التلألؤ الكيميائي باستخدام خط المرشح العازل للمجال المكثف الذي يأخذ عينات من الهواء المحيط. أعد وضع الغطاء الموجود على وعاء التطهير وقم بتوصيل خط المرشح العازل للمجال المكثف بوعاء التطهير.استخدم صمام الإبرة للوصول إلى نفس ضغط الخلية عند مستوى كاشف التلألؤ الكيميائي المسجل في الهواء المحيط. لبدء تشغيل برنامج اكتساب إشارة التلألؤ الكيميائي، قم بتوصيل المنفذ التسلسلي لكاشف التلألؤ الكيميائي بالمنفذ التسلسلي للكمبيوتر الذي تم تثبيت برنامج الاكتساب عليه. ثم قم بتشغيل برنامج التحليل.انقر فوق اكتساب ، ثم حدد المجلد لحفظ ملف البيانات ، واكتب اسم الملف ، وانقر فوق حفظ. أثناء التحضير لحقن العينة، اضبط مقياس الجهد على الشاشة للتحكم في خط الأساس المستهدف بالنقر فوق الأزرار الدنيا و/أو القصوى، ثم إدخال القيمة المطلوبة. لإجراء حقن العينة، اشطف المحقنة مرتين أو أكثر على الأقل بالماء منزوع الأيونات والمقطر قبل سحب كل عينة، وتأكد من إخراج الماء دون عائق على مسح المهمة.ثم أدخل المحقنة في أنبوب العينة مع الاحتفاظ بكل من المحقنة والأنبوب على مسافة قريبة واسحب المكبس إلى الحجم المطلوب مع ضمان عدم وجود فقاعة هواء أو أجزاء صلبة غير متجانسة. نظف طرف المحقنة باستخدام ممسحة المهام وأدخل المحقنة في غطاء الضبط في منفذ الحقن. بعد التحقق من أن طرف المحقنة ضمن المرحلة السائلة ، قم بحقن العينة في غرفة التفاعل.لوضع علامة على الحقن في البرنامج ، اكتب اسم العينة بالنقر فوق المربع الرمادي ضمن أسماء العينات ، ثم انقر فوق Mark Injection أثناء التحقق من أن الحقن يسبب تغييرا صعوديا في الإشارة أو لأسفل في استهلاك أكسيد النيتريك عن طريق فحص الهيموغلوبين الخالي من الخلايا. تم قياس علاقة الاستجابة للجرعة بين الهيموغلوبين الخالي من الخلايا واستهلاك أكسيد النيتريك من خلال التلألؤ الكيميائي بعد المجازة القلبية الرئوية. يمكن افتراض أن هناك تركيزا عاليا من مجموعات الهيم في الحالة المؤكسدة لإزالة أكسيد النيتريك.في المرضى الذين يتلقون أكسيد النيتريك أثناء المجازة القلبية الرئوية ، بدلا من ذلك ، يتم تقليل غالبية مجموعات الهيم ولا تستهلك أكسيد النيتريك. أشارت قياسات تركيز الهيموغلوبين الخالي من الخلايا إلى التخلص البطيء من البلازما في غضون 12 ساعة بعد المجازة القلبية الرئوية. ومع ذلك ، بلغ استهلاك أكسيد النيتريك ذروته في 15 دقيقة ولم يعكس القضاء على الهيموغلوبين الخالي من الخلايا.أظهرت منحنيات الانحدار الخطي لاستهلاك أكسيد النيتريك بواسطة الهيموغلوبين الخالي من الخلايا انتشارا للهيموغلوبين المؤكسد والمستهلك لأكسيد النيتريك في 15 دقيقة ، مقابل انخفاض الهيموجلوبين عند خط الأساس 4 ساعات و 12 ساعة بعد المجازة القلبية الرئوية. تم رصد آثار إعطاء غاز أكسيد النيتريك على استهلاك أكسيد النيتريك. عندما عولج المرضى بغاز أكسيد النيتريك أثناء وبعد العملية الجراحية ، لم تقترن الزيادة الملحوظة في الهيموغلوبين الحر بعد المجازة القلبية الرئوية بأي زيادة في استهلاك أكسيد النيتريك.أشارت النتائج إلى أن أكسيد النيتريك الذي يتم إعطاؤه خارجيا يقلل من معظم الهيموغلوبين الحر ويمنع كسح أكسيد النيتريك. لا تكون التجربة صالحة إلا إذا ظلت جميع الشروط كما هي. إذا تجاوز ارتفاع مستوى السائل عمود التفاعل ، فيجب أن نتوقف ونجري معايرة جديدة.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

كشف وGenogrouping من Noroviruses من براز الأطفال وذلك في خطوة واحدة Taqman RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

الإنتاج والكشف عن أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) في السرطان

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

التحليلية تقنيات يعاير النيتريك النشاط الحيوي أوكسيد

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

كيرينكوف التصوير التلألؤ (CLI) لرصد علاج السرطان

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th استئصال الكلية في تركيبة مع حمية عالية الملح والنيتريك أوكسيد تثبيط سينسيز للحث على مرض الكلى المزمن في الفئران لويس

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

الهلام بولي أكريلاميد لInvadopodia وقوة الجر فحوصات على خلايا سرطان

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

جرأة، العدوان، وفحوصات Shoaling للاسماك الزرد السلوكية المتلازمات

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

تركيب وتوصيف وتطبيق مسابر نانوية لأكسيد الحديد فائق المغناطيسية للكشف عن السل خارج الرئة

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

الكشف على أساس الصفائح الدموية من أكسيد النيتريك في الدم عن طريق قياس الفسفرة بسب

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

نظام قناع استنشاق جديد لتقديم تركيزات عالية من غاز أكسيد النيتريك في مواضيع التنفس التلقائي

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...