Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Protokollerne rapporteret i dette manuskript blev muliggjort af de akkumulerede bidrag fra tidligere stipendiater fra Dr. Warren Zapols laboratorium for anæstesiforskning i kritisk pleje, Anæstesiafdelingen på Massachusetts General Hospital. Vi anerkender bidraget fra Dr. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli og Emanuele Rezoagli.

De procedurer, der er angivet i denne protokol, er i overensstemmelse med review board of Massachusetts General Hospital. De blodprøver, der blev brugt, var blevet indsamlet under en tidligere undersøgelse og blev afidentificeret til det nuværende formål18.
BEMÆRK: Se producentens anvisninger for specifik vejledning vedrørende optimale forbindelser mellem slanger og glasvarer, der udgør udrensningsbeholderen, vask og generel vedligeholdelse. Forbindelserne skal v...

På grund af den høje følsomhed har kemiluminescensbaserede assays til bestemmelse af NO og beslægtede forbindelser en høj risiko for NO 2-kontaminering. Hvert reagens (isærNO2-blokerende opløsning) og fortyndingsmiddel (herunder ddH2O), der anvendes i forsøget, bør testes for dets NO 2-indhold for at korrigere for baggrundssignal. Nitrit er ekstremt reaktivt med en halveringstid i fuldblod omkring 10 min og genererer hurtigt NO3</s...

Siden Salvador Moncada og nobelpristagerne Robert Furchgott, Louis Ignarro og Ferid Murad identificerede nitrogenoxid (NO) som den tidligere kendte endotelafledte afslapningsfaktor (EDRF), er NO's centrale rolle blevet etableret i flere nøglemekanismer, der spænder over vaskulær biologi, neurovidenskab, metabolisme og værtsrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Eksogen administration af NO-gas er blevet en etableret behandling for respirationssvigt på grund af pulmonal hypertension hos den nyfødte8. Nitrogenoxidgas er også blevet undersøgt til behandling af respiratorisk syncytialvirus (RSV) infektion, malaria og andre infektionssygdomme, iskæmi-reperfusionsskade og til forebyggelse af akut nyreskade hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi 9,10,11,12. Behovet for præcise måleteknikker til vurdering af niveauerne af NO, dets metabolitter og niveauerne af dets målproteiner og forbindelser stammer fra både mekanistiske og interventionelle undersøgelser.
På grund af sin høje reaktivitet kan NO gennemgå forskellige reaktioner afhængigt af den biologiske matrix, hvori den produceres og/eller frigives. I mangel af hæmoglobin (Hb) eller andre oxy-hæmoproteiner oxideres NO næsten fuldstændigt til nitrit (NO2-).
2NO + O2 → 2NO2
NO2 + NO → N2O3
N2O3 +H20→ NO2- + H+
NO gennemgår først autoxidation med molekylært oxygen (O2) for at give nitrogendioxid (NO2) og reagerer medNO2 selv for at generere dinitrogentrioxid (N203). Et molekyleN203reagerer med vand (H20) for at danne to molekyler afNO2- og en proton (H +)13. Inden for fuldblodomdannes 14,15, NO og NO2- hurtigt til nitrat (NO3-), da disse molekyler reagerer ivrigt med de oxiderede hæmgrupper af Hb [Hb-Fe2+-O2 eller oxyhemoglobin (oxyHb)] for at give NO3-. Denne reaktion er kombineret med overgangen af hæmgruppen til jerntilstanden [Hb-Fe3+ eller methemoglobin (metHb)]:
Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-
Barrieren for røde blodlegemer (RBC) og rummet umiddelbart ved siden af endotelet er de vigtigste faktorer, der begrænser denne reaktion og tillader en lille del af NO frigivet af endotelet at fungere som EDRF16,17. Faktisk er cellefri Hb i cirkulationen kendt for at forstyrre vasodilatation i eksperimentelle og kliniske indstillinger17,18. Inden for RBC, afhængigt af iltning ogNO2-koncentration, reagerer en del af NO med deoxyhemoglobin (Hb-Fe2+) for at danne jern-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO eller HbNO):
Hb-Fe2+ + INGEN → Hb-Fe2+-NO
I RBC15,17 kan NO2- danne Hb-Fe3+ ved at reducere Hb-Fe2+, hvilket fører til frigivelse af NO, hvilket igen binder Hb-Fe2+-O2 (fortrinsvis) eller Hb-Fe2+.
Generering af NO-derivater bør ikke betragtes som strengt ensrettet, da NO kan regenereres fra NO2- og NO3- i forskellige væv og af forskellige enzymer (f.eks. af tarmbakterier eller i mitokondrier, især under hypoxiske tilstande)19,20.
En variabel mængde NO produceret (eller administreret) fører til downstream-generering af S-nitrosothioler, hovedsagelig ved thioltransnitrosation fraN203i nærvær af en nukleofil, der skaber et NO+ -donormellemprodukt (Nuc-NO+-NO2-):
N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-
En anden mulighed for generering af S-nitrosothioler er nitrosylering af oxiderede thioler (NO reagerer med en oxideret thiol):
RS• + INGEN → RS-NO
Denne mekanisme og direkte thioloxidation ved NO2 kan kun være mulig under meget specifikke forhold, som er beskrevet andetsteds21. S-nitrosothioler spænder fra lette molekyler som S-nitrosoglutathion til store thiolholdige proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) dannes ved nitrosering af en thiolgruppe af en konserveret cysteinrest i β(β93C)22.
Generering og metabolisme af S-nitrosothioler er en del af vigtige reguleringsmekanismer. Eksempler indbefatter regulering af glutathion, caspaser, N-methyl-D-aspartat (NMDA) og ryanodinreceptorer 23,24,25,26,27,28. Nitroseret albumin (S-nitroso-albumin), der tidligere blev betragtet som en vigtig formidler af NO-biologi in vivo, synes at være en NO/NO+-transportør uden nogen specifik yderligere biologisk aktivitet29.
Ved måling af koncentrationen af NO og dets derivater fra en specifik biologisk prøve inden for en biologisk matrix er det vigtigt at overveje egenskaber som surhedsgrad, iltning, temperatur og tilstedeværelsen af reagenser. Eksempler indbefatter administrerede eksogene NO-donorer og, i forbindelse med akut inflammation, hydrogenperoxid (H202), der reagerer medNO2, hvilket fører til generering af supernormal koncentration af frie radikaler som peroxynitrit (ONOO-)21. Ud over den anvendte analysemetode er den præanalytiske fase af prøveforberedelse og opbevaring grundlæggende. Downstreamreaktioner, der ikke repræsenterer in vivo NO-aktiviteten, skal forudsiges, overvejes og blokeres. Et gyldigt eksempel er ustabiliteten af S-NO-Hb, der kræver en dedikeret behandling af blodprøver, når den er målrettet til måling22.
Chemiluminescensbaserede assays er guldstandarden til påvisning af niveauerne af NO og dets vigtigste metabolitter [NO2-, NO3-, S-NO- og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NO)] i enhver biologisk væske, herunder vævshomogenater30,31. Disse metoder er afhængige af kemiluminescensdetektoren (CLD), en enhed, der huser reaktionen af NO med ozon (O3), hvilket genererer NO2 i en ophidset tilstand (NO2•). Afslapning af NO2• forårsager emission af en foton af lys, der detekteres af et fotomultiplikatorrør, hvilket genererer et elektrisk signal, der er direkte proportionalt med NO-indholdet i den samplede gasblanding32. En forenklet skematisk oversigt over CLD er repræsenteret.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg"> Figur 1: Forenklet skematisk for en kemiluminescensdetektor for nitrogenoxidgas. Kemiluminescensbaseret detektion af nitrogenoxid (NO) er den støkiometriske generering af en foton pr. NO-gasmolekyle, der indføres i kemiluminescensdetektoren (CLD). Kemiluminescensreaktionen opnås i et udpeget kammer forsynet med ozon (O3) fra en intern generator, som holdes ved undertryk ved forbindelse med en ekstern pumpe, hvilket muliggør kontinuerlig og konstant tilstrømning af prøvegas. Genereringen afO3 kræver diatomisk ilt (O2), der leveres af en dedikeretO2-tank , der er forbundet med CLD (andre producenter leverer CLD'er, der opererer med omgivende luft). Inden for reaktionskammeret reagerer hvert molekyle af NO-gas indeholdt i den samplede gas med ilt for at give et molekyle nitrogendioxid i aktiveret tilstand (NO2 *). Ved at vende tilbage til sin grundtilstand udsender hvert NO2 * molekyle en foton, der detekteres af et fotomultiplikatorrør (PMT) placeret ved siden af reaktionskammeret. PMT med den tilhørende forstærker og centrale behandlingsenhed producerer et signal, der er proportionalt med fotontællingen og antallet af NO-molekyler i reaktionskammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Prøveindslysningen af CLD kan tilsluttes et glasvaresystem, der indeholder et reaktionskammer til flydende prøver. Systemet renses kontinuerligt med en inert gas, såsom nitrogen, helium eller argon, der overfører NO fra reaktionskammeret til CLD. Væskefaseprøver injiceres gennem en dedikeret membran i udrensningsbeholderen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg"> Figur 2: Struktur af et udrensningsfartøj til kemiluminescensbaseret detektion af nitrogenoxidgas Udrensningsbeholderen (til højre) gør det muligt at detektere nitrogenoxid (NO) gas eller enhver anden forbindelse, der let kan omdannes til INGEN gas, når den frigives fra et flydende fasereagens. Det inerte gasindgang er forbundet med en kilde (tank) af en inert gas, såsom Argon, Xeon eller diatomisk nitrogen (N2). Nåleventilen (åbner til venstre) bruges til trykregulering i udrensningsbeholderen og kan fjernes fuldstændigt for at rengøre beholderen. Injektionsporten er dækket af en hætte med en membranseptum til prøveinjektion. Membranen skal udskiftes ofte. En opvarmet jakke omgiver reaktionskammeret og er forbundet til et varmtvandsbad for at udføre VCl3 i HCL-assay. Udrensningsbeholderudløbet er forbundet til kemiluminescensdetektoren (CLD) eller til NaOH-fælden (kræves til VCl3 i HCl-assays). For at dræne reaktionskammerets indhold skal du først lukke stophanerne ved det inerte gasindløb og udrensningsbeholderens udløb, lukke nåleventilen, fjerne hætten ved injektionsporten og til sidst åbne stophanen ved afløbet. NaOH-fælden (til venstre) skal placeres inline mellem udrensningsbeholderen og CLD'en, hvis VCl3 i HCl-assay udføres på grund af HCI's ætsning. Forbindelsen til CLD kræver altid, at der placeres et intenst felt dielektrisk filter (IFD) mellem CLD og udgangen fra udrensningsbeholderen (eller NaOH-fælden, hvis den anvendes). IFD-filteret fjerner luftbårne partikler og forhindrer væske i at passere gennem udrensningsbeholderen. PTFE = polytetrafluorethylen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Som følge heraf kan enhver forbindelse, der kan omdannes til NO gennem en specifik og kontrolleret kemisk reaktion, påvises med høj følsomhed i enhver biologisk væske og vævshomogenat24. Direkte måling af gasfase NO gennem kemiluminescens udføres i både eksperimentelle og kliniske omgivelser. Disse teknikker er udførligt beskrevet andetsteds 33,34,35. Måling af NO2-, S-nitrosothioler, S-nitrositrerede proteiner og Fe-NO'er kan udføres ved at tilsætte prøver i en reaktionsblanding med triiodid (I3-), som støkiometrisk frigiver INGEN gas fra alle disse forbindelser:
I3- → I2 + I-
2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
mens jeg3- ikke reagerer med NO 3-15. Præcise målinger af hver forbindelse er muliggjort ved forbehandling af prøveallikvoter med syrnet sulfanilamid (AS) med eller uden mercuricchlorid (HgCl2). Konkret fjerner forbehandling med AS alt NO 2-indhold. Som følge heraf afspejler NO-indholdet målt ved CLD kun summen af S-NOs og Fe-NOs koncentration. Injektion af HgCl2 i en prøveallikvote før AS-injektion medfører, at NO2- frigives af S-NO. Behandling med AS (hvilket fører til NO 2-fjernelse) sikrer, at det målte NO-indhold kun afspejler koncentrationen af Fe-NO'er. En række subtraktioner mellem vurderingerne gør det muligt at beregne den nøjagtige koncentration af de tre NO-derivater22.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg"> Figur 3: Trin i prøveforberedelse tilI3- i eddikesyre chemiluminescensassay. De sekventielle trin til fremstilling afI3- i eddikesyre chemiluminescensassay er illustreret. Brug af lysbeskyttede centrifugerør er påkrævet. Rør 1, 2 og 3 er dem, der bruges til at forberede sig på analysen. En anden prøve aliquot (rør 4) er nødvendig for VCl3 i HCI-assay, hvis måling af nitrat (NO3-) er påkrævet. Trin er angivet med tal med rødt. Forfyld (trin 1) som angivet med fosfatbuffer saltvand (PBS) ellerHgCl2, inden prøvevolumenet tilsættes. Tilsæt prøvevolumen (2) som angivet, hvirvel, og inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur (RT). Tilsæt (3) PBS eller syrnet sulfanilamid (AS) som angivet, hvirvel, og inkuber i 3 minutter ved RT. Koncentrationen målt ved assay er summen af koncentrationen af de forbindelser, der er rapporteret under hvert rør. Rør nummer 1 vil tillade målinger af nitrit (NO2-), S-nitrosothioler (S-NO) og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NO'er) som et enkelt signal. Ved måling af nitrat (NO3-) skal der udtages prøver med bådeI3- i eddikesyre ogVCl3 i HCl-assays, og værdien fra rør 1 skal trækkes fra den, der er opnået fra rør 4. *foreslåede mængder, der skal anvendes til Hb-analyse til bestemmelse af resterende NO2-, S-nitrosohemoglobin og jern-nitrosyl-hæmoglobin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Ved MÅLING NR. 3- anvendes vanadiumchlorid (III)chlorid (VCl3) i saltsyre (HCI) til omdannelse afNO3- til NO i udrensningsbeholderen med henblik på at måle NO3- støkiometrisk med CLD:
2 NO3-+ 3V+3 + 2H20 → 2NO+ 3VO2+ + 4H+
For at opnå en tilstrækkelig hurtig omdannelse skal reaktionen udføres ved 90-95 °C. Reduktion fra NO3- til NO2- er kombineret med reduktion af NO2- til NO med HCl. Vanadiummetal reducerer også S-NO'er, der frigør deres NO-moiety22,36. Den endelige koncentration opnået ved CLD medVCl3 i HCl afspejler den samlede koncentration afNO3-,NO2 og andre nitroserede forbindelser. Subtraktion af sidstnævnte værdi fra koncentrationen opnået med CLD med I3- gør det muligt at beregne NO 3-koncentration 36,37 (figur 3).
I NO-forbrugsassayet genererer den kontinuerlige frigivelse af NO i udrensningsbeholderen af NO-donorer som (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) et stabilt signal, der gør det muligt at kvantificere cellefri oxyHb i de injicerede prøver. Mængden af NO, der forbruges i udrensningsbeholderen, er i et støkiometrisk forhold til mængden af oxyHb i prøven38.
Protokoller til måling af NO2-, NO3-, S-nitrosothioler, jern-nitrosylkomplekser og INTET forbrug af cellefri Hb i plasmaprøver er illustreret. Undersøgelser af NO i RBC-miljøet kræver specifik prøvebehandling efterfulgt af udelukkelseskromatografi for at måle ekstremt skrøbelig S-NO-Hb og Hb-NO kombineret med bestemmelse af total Hb-koncentration15,22. Prøveforberedelse er medvirkende til at korrigere målingen. Præ-eksistens af NO2- iH20og frigivelse afNO2- under analysen kan føre til måling af kunstigt højere koncentrationer af NO-derivater såsom S-NO-Hb14,39. Vigtige aspekter af prøveforberedelse præsenteres også.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

Nitrogenoxid (NO) aktivitet in vivo er de kombinerede resultater af dets direkte virkninger, virkningen af dets derivater genereret af NO autoxidation og virkningerne af nitroserede forbindelser. Måling af NO-metabolitter er afgørende for at studere NO-aktivitet både på vaskulære niveauer og i andre væv, især i de eksperimentelle indstillinger, hvor eksogen NO administreres. Ozonbaserede kemiluminescensassays muliggør præcise målinger af NO- og NO-metabolitter i både væsker (herunder plasma, vævshomogenater, cellekulturer) og gasblandinger (f.eks. Udåndingsåndedræt). NO reagerer med ozon for at generere nitrogendioxid i en ophidset tilstand. Den deraf følgende lysemission tillader fotosektion og generering af et elektrisk signal, der afspejler NO-indholdet i prøven. Aliquots fra den samme prøve kan bruges til at måle specifikke NO-metabolitter, såsom nitrat, nitrit, S-nitrosothioler og jern-nitrosylkomplekser. Derudover kvantificeres NO forbruges af cellefrit hæmoglobin også med kemiluminescensanalyse. En illustration af alle disse teknikker er tilvejebragt.

NO-forbruget ved cellefrit Hb-assay blev anvendt i prøver, der indeholdt kendte koncentrationer af cellefri oxyHb (figur 4). Da en hæm af oxyHb stoichiometrisk frigiver et NO-molekyle i analysen, anvendes renset cellefri oxyHb til at opbygge kalibreringskurven for assayet (supplerende figur 3).
Dosis-respons-forholdet mellem cellefri Hb (målt med et kolorimetrisk assay) og INTET forbrug hos patienter, der kommer ud af kardiopulmonal bypass (CPB...

Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Her præsenterer vi protokoller til påvisning af nitrogenoxid og dets biologisk relevante derivater ved hjælp af kemiluminescensbaserede assays med høj følsomhed.

Chemiluminescensbaserede assays til påvisning af nitrogenoxid og derivater heraf fra autoxidation og nitroserede forbindelser

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Denne protokol gør det muligt for forskere dygtigt at anvende en kemiluminescensdetektor til måling af nitrogenoxidmetabolitter uden vejledning eller udgifter til at ansætte dedikeret personale på stedet. Chemiluminescensbaseret assay er den mest følsomme metode til at påvise minimale ændringer i niveauerne af nitrogenoxid og dets metabolitter i en given biologisk prøve. Indåndet nitrogenoxid er en terapeutisk gas, der anvendes til en lang række sygdomme.Det er afgørende, at sygdomsprogression og genopretning korreleres nøjagtigt med nitrogenoxidmetabolitniveauer. Indåndet nitrogenoxid, et antimikrobielt stof, viser løfte om behandling af patienter med luftvejsinfektionssygdomme. Kemiluminescensmetoden giver indsigt i korrelerende nitrogenoxiddosis og dens metabolitter med mikrobiologiske og patofysiologiske ændringer.For at fremstille DETA-NONOate-opløsningen tilsættes 10 mg DETA-NONOate til 610 mikroliter 10 millimolært natriumhydroxid i PBS med pH 7,4 for at generere 100 millimolær DETA-NONOate og holde det på is. For at fortsætte skal du forbinde iltledningen til kemiluminescensdetektoren og åbne ilttanken ved et tryk i henhold til producentens instruktion i teksten. Tilslut derefter den dielektriske filterlinje med intenst felt til kemiluminescensdetektoren.På kemiluminescensdetektorgrænsefladen skal du begynde at køre detektionsprogrammet til væskefaseassays, hvilket sikrer, at iltforsyningen er tilstrækkelig, og detektoren begynder at prøve, hvilket indikerer detektion med signal i millivolt, ellers beder om et negativt diagnostisk signal. For at forberede udrensningsbeholderen skal du lukke udrensningsbeholderen på alle tre havne ved at skrue nåleventilen helt til højre og lukke indløbs- og udløbsstophanerne. Fjern hætten fra udrensningsbeholderen.Der tilsættes en tilstrækkelig mængde af det reagens, der er specifikt for det planlagte assay, til reaktionskammeret, således at sprøjtenålen, der anvendes til at injicere prøverne, kan nå væskekolonnen, samtidig med at tilstedeværelsen af en stabil, ønsket basislinje verificeres. For at starte udrensningsgasstrømmen skal du sikre dig, at den inerte gastank er udstyret med en to-trins regulator, og tilslut den inerte gastank med beholderens gastilløb. Åbn derefter udrensningsbeholderens udløb og åbn gassen med et udløbstryk ved regulatoren på en til fem pund pr. Kvadrattomme.Åbn derefter indløbet til udrensningsbeholderen og åbn langsomt nåleventilen på udrensningsbeholderen for at tillade tilstrømning af gas og kontrollere boblende i udrensningsbeholderen. For at justere gasstrømmen skal du registrere celletrykket målt af kemiluminescensdetektoren med den intense felt dielektriske filterlinje, der prøver omgivende luft. Flyt hætten på udrensningsbeholderen, og tilslut den dielektriske filterlinje med intenst felt til udrensningsbeholderen.Brug nåleventilen til at nå det samme celletryk på kemiluminescensdetektorniveauet, der registreres i den omgivende luft. For at starte kemiluminescenssignaloptagelsesprogrammet skal du slutte den serielle port på kemiluminescensdetektoren til computerens serielle port, hvor anskaffelsesprogrammet er installeret. Kør derefter analyseprogrammet.Klik på Erhverv, vælg derefter mappen for at gemme datafilen, indtast filnavnet, og klik på Gem. Mens du forbereder dig på prøveinjektion, skal du justere spændingsskalaen på skærmen for at have kontrol over den målrettede basislinje ved at klikke på minimums- og / eller maksimumsknapperne og derefter indtaste den ønskede værdi. For at udføre prøveinjektionen skal sprøjten skylles mindst to gange eller mere med deioniseret og destilleret vand, inden hver prøve trækkes ud, og der sikres en uhindret vandudstødning på en opgaveaftørring.Indsæt derefter sprøjten i prøverøret, mens du holder både sprøjten og røret i tæt afstand, og træk stemplet op til det ønskede volumen, samtidig med at det sikres, at ingen luftboble eller ikke-homogeniserede faste dele er fanget. Rengør spidsen af sprøjten med en opgavevisker, og sæt sprøjten i setterhætten ved injektionsporten. Efter at have kontrolleret, at spidsen af sprøjten er inden for væskefasen, injiceres prøven i reaktionskammeret.For at markere injektionen i softwareprogrammet skal du skrive prøvenavnet ved at klikke på den grå boks under Prøvenavne og derefter klikke på Markér injektion, mens du kontrollerer, at injektionen forårsager en opadgående ændring i signalet eller nedad i nitrogenoxidforbruget ved cellefri hæmoglobinassay. Dosisresponsforholdet mellem cellefrit hæmoglobin og nitrogenoxidforbrug blev målt gennem kemiluminescens efter kardiopulmonal bypass. Det kan antages, at der er en høj koncentration af hæmgrupper i den oxiderede status, der oprenser nitrogenoxid.Hos patienter, der får nitrogenoxid under kardiopulmonal bypass, reduceres i stedet størstedelen af hæmgrupperne og forbruger ikke nitrogenoxid. Målinger af cellefri hæmoglobinkoncentration indikerede en langsom eliminering fra plasma inden for 12 timer efter kardiopulmonal bypass. Imidlertid toppede nitrogenoxidforbruget efter 15 minutter og afspejlede ikke elimineringen af cellefrit hæmoglobin.De lineære regressionskurver for nitrogenoxidforbrug af cellefrit hæmoglobin udviste en forekomst af oxideret og nitrogenoxidforbrugende hæmoglobin efter 15 minutter i modsætning til mere reduceret hæmoglobin ved baseline 4 timer og 12 timer efter kardiopulmonal bypass. Virkningerne af administration af nitrogenoxidgas på nitrogenoxidforbruget blev overvåget. Når patienterne blev behandlet med nitrogenoxidgas intra- og postoperativt, var den observerede stigning i frit hæmoglobin efter kardiopulmonal bypass ikke kombineret med nogen stigning i nitrogenoxidforbruget.Resultaterne viste, at eksogent administreret nitrogenoxid reducerede det meste af det frie hæmoglobin og forhindrede nitrogenoxidoprensning. Eksperimentet er kun gyldigt, hvis alle betingelser forbliver de samme. Hvis væskeniveauets højde overstiger reaktionskolonnen, skal vi stoppe og foretage en ny kalibrering.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Detektion og Genogrouping af norovira fra børne Taburetter Ved Taqman Et-trins RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion og Påvisning af Reactive Oxygen Species (ROS) i kræft

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Analytiske teknikker til analyse af nitrogenoxid Bioaktivitet

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Polyakrylamidgeler for Invadopodia og Trækkraft Analyser på kræftceller

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Dristighed, aggression og shoaling Analyser for zebrafisk Adfærdsmæssige syndromer

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Syntese, karakterisering og anvendelse af superparamagnetiske jernoxid nanosonder til ekstrapulmonal tuberkulosedetektion

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Trombocyt-baseret detektion af nitrogenoxid i blodet ved at måle VASP fosforylering

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

En ny indånding Mask System til at levere høje koncentrationer af nitrogenoxid gas i spontant vejrtrækning Emner

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...