Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
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Les protocoles rapportés dans ce manuscrit ont été rendus possibles grâce aux contributions accumulées par d’anciens boursiers du laboratoire de recherche en anesthésie en soins intensifs du Dr Warren Zapol, département d’anesthésie du Massachusetts General Hospital. Nous reconnaissons la contribution des Drs Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli et Emanuele Rezoagli.

Les procédures indiquées dans ce protocole sont conformes au comité d’examen du Massachusetts General Hospital. Les échantillons de sang utilisés avaient été prélevés lors d’une étude précédente et ont été anonymisés aux fins actuelles18.
REMARQUE: Voir les instructions du fabricant pour des conseils spécifiques concernant les connexions optimales entre les tubes et la verrerie constituant le récipient de purge, le lavage et l’entretien général....

En raison de la sensibilité élevée, les tests à base de chimiluminescence pour la détermination du NO et des composés apparentés présentent un risque élevé de contamination par le NO2. Chaque réactif (en particulier la solution bloquant le NO2) et chaque diluant (y compris le ddH2O) utilisé dans l’expérience doivent être testés pour sa teneur en NO2- afin de corriger le signal de fond. Le nitrite est extrêmement réactif avec u...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

L’activité de l’oxyde nitrique (NO) in vivo est le résultat combiné de ses effets directs, de l’action de ses dérivés générés par l’autoxidation du NO et des effets des composés nitrosés. La mesure des métabolites du NO est essentielle pour étudier l’activité du NO à la fois au niveau vasculaire et dans d’autres tissus, en particulier dans les milieux expérimentaux où le NO exogène est administré. Les tests de chimiluminescence à base d’ozone permettent de mesurer avec précision les métabolites du NO et du NO dans les fluides (y compris le plasma, les homogénats tissulaires, les cultures cellulaires) et les mélanges gazeux (p. ex., l’haleine expirée). Le NO réagit avec l’ozone pour générer du dioxyde d’azote dans un état excité. L’émission de lumière qui en résulte permet la photodétection et la génération d’un signal électrique reflétant la teneur en NO de l’échantillon. Les aliquotes du même échantillon peuvent être utilisées pour mesurer des métabolites spécifiques du NO, tels que le nitrate, le nitrite, les S-nitrosothiols et les complexes fer-nitrosyle. En outre, le NO consommé par l’hémoglobine sans cellules est également quantifié avec une analyse de chimiluminescence. Une illustration de toutes ces techniques est fournie.

La consommation de NO par dosage de l’Hb sans cellules a été utilisée dans des échantillons contenant des concentrations connues d’oxyHb sans cellules (figure 4). Comme un hème d’oxyHb libère stœchiométriquement une molécule de NO dans le test, l’oxyHb purifié sans cellule est utilisé pour construire la courbe d’étalonnage pour le test (figure supplémentaire 3).
La relation dose-réponse entre l’Hb sans cellules (mesurée ...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nous présentons ici des protocoles de détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés biologiquement pertinents à l’aide de tests basés sur la chimiluminescence avec une sensibilité élevée.

Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Ce protocole permet aux chercheurs d’utiliser efficacement un détecteur de chimiluminescence pour la mesure des métabolites de l’oxyde nitrique sans les conseils ou les frais liés à l’emploi de personnel dédié sur place. Le test basé sur la chimiluminescence est la méthode la plus sensible pour détecter des changements minimes dans les niveaux d’oxyde nitrique et de ses métabolites dans un échantillon biologique donné. L’oxyde nitrique inhalé est un gaz thérapeutique utilisé pour une grande variété de maladies.Il est crucial que la progression et la récupération de la maladie soient précisément corrélées avec les niveaux de métabolites de l’oxyde nitrique. L’oxyde nitrique inhalé, un antimicrobien, est prometteur dans le traitement des patients atteints de maladies infectieuses des voies respiratoires. La méthode de chimiluminescence permet de corréler la dose d’oxyde nitrique et ses métabolites avec les changements microbiologiques et physiopathologiques.Pour préparer la solution de DETA-NONOate, ajouter 10 milligrammes de DETA-NONOate à 610 microlitres d’hydroxyde de sodium de 10 millimolaires dans du PBS de pH 7,4 pour générer 100 millimolaires de DETA-NONOate et le maintenir sur glace. Pour continuer, connectez la conduite d’oxygène au détecteur de chimiluminescence et ouvrez le réservoir d’oxygène à une pression conformément aux instructions du fabricant fournies dans le texte. Ensuite, connectez la ligne de filtre diélectrique à champ intense au détecteur de chimiluminescence.Sur l’interface du détecteur de chimiluminescence, commencez à exécuter le programme de détection pour les tests en phase liquide, en vous assurant que l’apport en oxygène est adéquat et que le détecteur commencera à échantillonner, indiquant la détection par signal en millivolts, sinon déclencher un signal de diagnostic négatif. Pour préparer le récipient de purge, fermez le récipient de purge sur les trois orifices en vissant complètement la vanne à aiguille vers la droite et en fermant les robinets d’arrêt d’entrée et de sortie. Retirez le bouchon du récipient de purge.Ajouter une quantité suffisante du réactif spécifique au dosage prévu dans la chambre de réaction afin que l’aiguille de la seringue utilisée pour injecter les échantillons puisse atteindre la colonne de fluide tout en vérifiant la présence d’une ligne de base stable et souhaitée. Pour démarrer le flux de gaz de purge, assurez-vous que le réservoir de gaz inerte est équipé d’un régulateur à deux étages et connectez le réservoir de gaz inerte à l’entrée de gaz du navire. Ensuite, ouvrez la sortie du récipient de purge et ouvrez le gaz avec une pression de sortie au régulateur de une à cinq livres par pouce carré.Ensuite, ouvrez l’entrée du récipient de purge et ouvrez lentement la vanne à aiguille du récipient de purge pour permettre l’entrée de gaz et vérifier le bouillonnement dans le récipient de purge. Pour ajuster le débit de gaz, enregistrez la pression de la cellule mesurée par le détecteur de chimiluminescence avec la ligne de filtre diélectrique à champ intense échantillonnant l’air ambiant. Repositionnez le capuchon sur la cuve de purge et reliez la ligne de filtre diélectrique à champ intense à la cuve de purge.Utilisez la valve à aiguille pour atteindre la même pression cellulaire au niveau du détecteur de chimiluminescence qui est enregistré dans l’air ambiant. Pour démarrer le programme d’acquisition du signal de chimiluminescence, connectez le port série du détecteur de chimiluminescence au port série de l’ordinateur dans lequel le programme d’acquisition a été installé. Ensuite, exécutez le programme d’analyse.Cliquez sur Acquérir, puis sélectionnez le dossier pour enregistrer le fichier de données, tapez le nom du fichier et cliquez sur Enregistrer. Lors de la préparation de l’injection de l’échantillon, ajustez l’échelle de tension à l’écran pour avoir le contrôle sur la ligne de base ciblée en cliquant sur les boutons minimum et/ou maximum, puis en entrant la valeur souhaitée. Pour effectuer l’injection de l’échantillon, rincez la seringue au moins deux fois ou plus avec de l’eau désionisée et distillée avant de prélever chaque échantillon, et assurez-vous d’une éjection d’eau non obstruée sur une lingette de travail.Ensuite, insérez la seringue dans le tube d’échantillonnage tout en maintenant la seringue et le tube à une distance rapprochée et remontez le piston jusqu’au volume souhaité tout en vous assurant qu’aucune bulle d’air ou pièce solide non homogénéisée n’est piégée. Nettoyez l’extrémité de la seringue à l’aide d’un essuie-glace de travail et insérez la seringue dans le capuchon du régleur au port d’injection. Après avoir vérifié que l’extrémité de la seringue se trouve dans la phase liquide, injecter l’échantillon dans la chambre de réaction.Pour marquer l’injection dans le logiciel, tapez le nom de l’échantillon en cliquant sur la case grise sous Noms des échantillons, puis cliquez sur Marquer l’injection tout en vérifiant que l’injection provoque un changement vers le haut dans le signal ou vers le bas dans la consommation d’oxyde nitrique par essai d’hémoglobine sans cellule. La relation dose-réponse entre l’hémoglobine sans cellules et la consommation d’oxyde nitrique a été mesurée par chimiluminescence après un pontage cardiopulmonaire. On peut supposer qu’il y a une forte concentration de groupes hémiques dans le statut oxydé piégeant l’oxyde nitrique.Chez les patients recevant de l’oxyde nitrique pendant le pontage cardiopulmonaire, la majorité des groupes hémiques sont réduits et ne consomment pas d’oxyde nitrique. Les mesures de la concentration d’hémoglobine sans cellules ont indiqué une élimination lente du plasma dans les 12 heures suivant le pontage cardiopulmonaire. Cependant, la consommation d’oxyde nitrique a culminé à 15 minutes et ne reflétait pas l’élimination de l’hémoglobine sans cellules.Les courbes de régression linéaire de la consommation d’oxyde nitrique par l’hémoglobine sans cellules ont montré une prévalence d’hémoglobine oxydée et consommant de l’oxyde nitrique à 15 minutes, par opposition à une hémoglobine plus réduite au départ 4 heures et 12 heures après le pontage cardiopulmonaire. Les effets de l’administration de gaz d’oxyde nitrique sur la consommation d’oxyde nitrique ont été surveillés. Lorsque les patients ont été traités avec du gaz d’oxyde nitrique intra et postopératoire, l’augmentation observée de l’hémoglobine libre après le pontage cardiopulmonaire n’a pas été associée à une augmentation de la consommation d’oxyde nitrique.Les résultats ont indiqué que l’oxyde nitrique administré de manière exogène réduisait la majeure partie de l’hémoglobine libre et empêchait le piégeage de l’oxyde nitrique. L’expérience n’est valable que si toutes les conditions restent les mêmes. Si la hauteur du niveau de liquide dépasse la colonne de réaction, nous devons nous arrêter et effectuer un nouvel étalonnage.

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