Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
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Die in diesem Manuskript berichteten Protokolle wurden durch die gesammelten Beiträge früherer Stipendiaten von Dr. Warren Zapols Labor für Anästhesieforschung in der Intensivmedizin, Abteilung für Anästhesie am Massachusetts General Hospital, ermöglicht. Wir danken Dr. Akito Nakagawa, Dr. Francesco Zadek, Dr. Emanuele Vassena, Dr. Chong Lei, Dr. Yasuko Nagasaka, Dr. Ester Spagnolli und Dr. Emanuele Rezoagli.

Die in diesem Protokoll angegebenen Verfahren entsprechen dem Überprüfungsausschuss des Massachusetts General Hospital. Die Blutproben, die verwendet wurden, waren während einer früheren Studie gesammelt worden und wurden für den aktuellen Zweckde-identifiziert 18.
HINWEIS: In den Anweisungen des Herstellers finden Sie spezifische Anleitungen zu optimalen Verbindungen zwischen Schläuchen und Glaswaren, die das Spülgefäß, das Waschen und die allgemeine Wartung b...

Aufgrund der hohen Sensitivität haben Chemilumineszenz-basierte Assays zur Bestimmung von NO und verwandten Verbindungen ein hohes Risiko einerNO2-Kontamination. Jedes Reagenz (insbesondere die NO-2-Blockierungslösung) und jedes Verdünnungsmittel (einschließlich ddH 2 O), das im Experiment verwendet wird, sollte auf seinenNO-2-Gehaltgetestet werden, um das Hintergrundsignal zu korrigieren. Nitrit ist extrem reaktiv mit einer Halbwertszeit im...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

Die Aktivität von Stickstoffmonoxid (NO) in vivo ist das kombinierte Ergebnis seiner direkten Wirkungen, der Wirkung seiner Derivate, die durch NO-Autoxidation erzeugt werden, und der Wirkung von nitrosierten Verbindungen. Die Messung von NO-Metaboliten ist für die Untersuchung der NO-Aktivität sowohl auf Gefäßebene als auch in anderen Geweben unerlässlich, insbesondere in den experimentellen Umgebungen, in denen exogenes NO verabreicht wird. Ozonbasierte Chemilumineszenz-Assays ermöglichen präzise Messungen von NO- und NO-Metaboliten sowohl in Flüssigkeiten (einschließlich Plasma, Gewebehomogenaten, Zellkulturen) als auch in Gasgemischen (z. B. ausgeatmeter Atem). NO reagiert mit Ozon, um Stickstoffdioxid in einem angeregten Zustand zu erzeugen. Die daraus resultierende Lichtemission ermöglicht die Photodetektion und die Erzeugung eines elektrischen Signals, das den NO-Gehalt der Probe reflektiert. Aliquots aus derselben Probe können verwendet werden, um spezifische NO-Metaboliten wie Nitrat, Nitrit, S-Nitrosothiole und Eisen-Nitrosyl-Komplexe zu messen. Darüber hinaus wird NO, das von zellfreiem Hämoglobin verbraucht wird, auch mit der Chemilumineszenzanalyse quantifiziert. Eine Illustration all dieser Techniken wird zur Verfügung gestellt.

Der NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay wurde in Proben verwendet, die bekannte Konzentrationen von zellfreiem oxyHb enthielten (Abbildung 4). Da ein Häm von oxyHb stöchiometrisch ein NO-Molekül im Assay freisetzt, wird gereinigtes zellfreies oxyHb verwendet, um die Kalibrierkurve für den Assay zu erstellen (Ergänzende Abbildung 3).
Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hb (gemessen mit einem kolorimetrischen Assay) und NO-Verbr...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, einen Chemilumineszenzdetektor für die Messung von Stickstoffmonoxidmetaboliten kompetent zu verwenden, ohne die Anleitung oder die Kosten für die Beschäftigung von engagiertem Personal vor Ort. Der Chemilumineszenz-basierte Assay ist die empfindlichste Methode, um minimale Veränderungen der Stickoxidspiegel und seiner Metaboliten in einer bestimmten biologischen Probe nachzuweisen. Inhaliertes Stickstoffmonoxid ist ein therapeutisches Gas, das für eine Vielzahl von Krankheiten verwendet wird.Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Fortschreiten und die Genesung der Krankheit genau mit den Stickoxid-Metabolitenspiegeln korreliert werden. Inhalatives Stickstoffmonoxid, ein antimikrobielles Mittel, ist vielversprechend bei der Behandlung von Patienten mit Atemwegsinfektionserkrankungen. Die Chemilumineszenzmethode liefert Einblicke in die Korrelation der Stickstoffmonoxiddosis und ihrer Metaboliten mit mikrobiologischen und pathophysiologischen Veränderungen.Um die DETA-NONOat-Lösung herzustellen, fügen Sie 10 Milligramm DETA-NONOat zu 610 Mikrolitern 10-Millimolar Natriumhydroxid in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu, um 100 Millimolar DETA-NONOate zu erzeugen und es auf Eis zu halten. Um fortzufahren, schließen Sie die Sauerstoffleitung an den Chemilumineszenzdetektor an und öffnen Sie den Sauerstofftank mit einem Druck gemäß den Anweisungen des Herstellers im Text. Schließen Sie dann die dielektrische Intensivfeldfilterleitung an den Chemilumineszenzdetektor an.Starten Sie an der Schnittstelle des Chemilumineszenzdetektors das Detektionsprogramm für Flüssigphasenassays, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffversorgung ausreichend ist, und der Detektor beginnt mit der Probenahme, was die Erkennung durch Signal in Millivolt anzeigt und andernfalls ein negatives Diagnosesignal auslöst. Um das Spülschiff vorzubereiten, schließen Sie das Spülgefäß an allen drei Anschlüssen, indem Sie das Nadelventil vollständig nach rechts schrauben und die Einlass- und Auslassbremshähne schließen. Entfernen Sie die Kappe vom Spülgefäß.Fügen Sie der Reaktionskammer eine ausreichende Menge des für den geplanten Assay spezifischen Reagenzes hinzu, damit die zur Injektion der Proben verwendete Spritzennadel die Flüssigkeitssäule erreichen kann, während das Vorhandensein einer stabilen, gewünschten Baseline überprüft wird. Um den Spülgasfluss zu starten, stellen Sie sicher, dass der Inertgastank mit einem zweistufigen Regler ausgestattet ist, und verbinden Sie den Inertgastank mit dem Gaseinlass des Schiffes. Öffnen Sie dann den Auslass des Spülbehälters und öffnen Sie das Gas mit einem Ausgangsdruck am Regler von ein bis fünf Pfund pro Quadratzoll.Öffnen Sie dann den Einlass des Spülbehälters und öffnen Sie langsam das Nadelventil des Spülbehälters, um den Zufluss von Gas zu ermöglichen und das Blubbern im Spülbehälter zu überprüfen. Um den Gasfluss einzustellen, zeichnen Sie den vom Chemilumineszenzdetektor gemessenen Zelldruck mit der dielektrischen Intensivfeldfilterleitung auf, die Umgebungsluft abtastet. Positionieren Sie die Kappe auf dem Spülbehälter neu und schließen Sie die dielektrische Intensivfeldfilterleitung an das Spülgefäß an.Verwenden Sie das Nadelventil, um den gleichen Zelldruck auf der Ebene des Chemilumineszenzdetektors zu erreichen, der in der Umgebungsluft aufgezeichnet wird. Um das Chemilumineszenz-Signalerfassungsprogramm zu starten, schließen Sie die serielle Schnittstelle des Chemilumineszenzdetektors an die serielle Schnittstelle des Computers an, in der das Erfassungsprogramm installiert wurde. Führen Sie dann das Analyseprogramm aus.Klicken Sie auf Erwerben, wählen Sie dann den Ordner aus, in dem die Datendatei gespeichert werden soll, geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Passen Sie während der Vorbereitung der Probeninjektion die Spannungsskala auf dem Bildschirm so an, dass sie die Kontrolle über die angestrebte Baseline hat, indem Sie auf die Schaltflächen Minimum und / oder Maximum klicken und dann den gewünschten Wert eingeben. Um die Probeninjektion durchzuführen, spülen Sie die Spritze mindestens zweimal oder länger mit entionisiertem und destilliertem Wasser ab, bevor Sie jede Probe entnehmen, und stellen Sie einen ungehinderten Wasserauswurf auf einem Aufgabentuch sicher.Setzen Sie dann die Spritze in das Probenröhrchen ein, während Sie sowohl die Spritze als auch das Röhrchen in einem engen Abstand halten, und ziehen Sie den Kolben auf das gewünschte Volumen hoch, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblase oder nicht homogenisierte feste Teile eingeschlossen werden. Reinigen Sie die Spitze der Spritze mit einem Aufgabenwischer und setzen Sie die Spritze am Einspritzanschluss in die Setterkappe ein. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass sich die Spitze der Spritze in der flüssigen Phase befindet, injizieren Sie die Probe in die Reaktionskammer.Um die Injektion im Softwareprogramm zu markieren, geben Sie den Probennamen ein, indem Sie auf das graue Feld unter Probennamen klicken, klicken Sie dann auf Injektion markieren, während Sie überprüfen, ob die Injektion eine Veränderung des Signals nach oben oder nach unten im Stickoxidverbrauch durch zellfreien Hämoglobin-Assay verursacht. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hämoglobin und Stickstoffmonoxidverbrauch wurde durch Chemilumineszenz nach kardiopulmonalem Bypass gemessen. Es ist davon auszugehen, dass es im oxidierten Status eine hohe Konzentration von Hämgruppen gibt, die Stickstoffmonoxid abfangen.Bei Patienten, die während des kardiopulmonalen Bypasses Stickoxid erhalten, ist die Mehrheit der Hämgruppen reduziert und verbraucht kein Stickstoffmonoxid. Messungen der zellfreien Hämoglobinkonzentration zeigten eine langsame Elimination aus dem Plasma innerhalb von 12 Stunden nach dem kardiopulmonalen Bypass. Der Stickoxidverbrauch erreichte jedoch mit 15 Minuten seinen Höhepunkt und spiegelte nicht die Eliminierung von zellfreiem Hämoglobin wider.Die linearen Regressionskurven des Stickstoffmonoxidverbrauchs durch zellfreies Hämoglobin zeigten eine Prävalenz von oxidiertem und stickoxidverbrauchendem Hämoglobin nach 15 Minuten, im Gegensatz zu einem stärker reduzierten Hämoglobin zu Studienbeginn von 4 Stunden und 12 Stunden nach dem kardiopulmonalen Bypass. Die Auswirkungen der Verabreichung von Stickoxidgas auf den Stickoxidverbrauch wurden überwacht. Wenn Patienten intra- und postoperativ mit Stickstoffmonoxidgas behandelt wurden, war der beobachtete Anstieg des freien Hämoglobins nach dem kardiopulmonalen Bypass nicht mit einem Anstieg des Stickoxidverbrauchs verbunden.Die Ergebnisse zeigten, dass exogen verabreichtes Stickstoffmonoxid den größten Teil des freien Hämoglobins reduzierte und das Abfangen von Stickoxid verhinderte. Das Experiment ist nur gültig, wenn alle Bedingungen gleich bleiben. Wenn die Höhe des Flüssigkeitsstandes die Reaktionssäule überschreitet, müssen wir anhalten und eine neue Kalibrierung durchführen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Erkennung und Genogrouping von Noroviren aus Kinder-Hocker mit der TaqMan One-Step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Forschung

Medizin

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

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Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Lumineszenz Imaging (CLI) for Cancer Therapy Überwachung

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrektomie in Kombination mit hohen Salz-Diät-und Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmung zu Chronic Kidney Disease in der Lewis-Ratte induzieren

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Mut, Aggression, und Shoaling Assays für Zebrabärblinge Behavioral Syndromes

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Synthese, Charakterisierung und Anwendung von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanosonden zur Erkennung von extrapulmonaler Tuberkulose

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Ein neuartiges Inhalationsmaskensystem zur Abgabe hoher Konzentrationen von Stickoxidgas bei spontan atmenden Probanden

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...