Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

הפרוטוקולים המדווחים בכתב יד זה התאפשרו הודות לתרומתם המצטברת של עמיתים קודמים במעבדתו של ד"ר וורן זפול לחקר ההרדמה בטיפול קריטי, המחלקה להרדמה בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס. אנו מכירים בתרומתם של ד"ר אקיטו נקגאווה, פרנצ'סקו זדק, עמנואלה ואסנה, צ'ונג ליי, יאסוקו נגאסאקה, אסתר ספאגנולי ועמנואלה רזואלי.

ההליכים המצוינים בפרוטוקול זה הם בהתאם לוועדת הבדיקה של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס. דגימות הדם שבהן נעשה שימוש נאספו במהלך מחקר קודם וזוהו בביטול למטרה הנוכחית18.
הערה: עיין בהוראות היצרן לקבלת הנחיות ספציפיות לגבי חיבורים אופטימליים בין צינורות וכלי זכוכית ?...

בשל הרגישות הגבוהה, בדיקות מבוססות כימילומינסנציה לקביעת NO ותרכובות קשורות יש סיכון גבוה לזיהום NO2. כל מגיב (במיוחדפתרון חסימת NO 2) ומדלל (כולל ddH2O) המשמשים בניסוי צריכים להיבדק לתוכן NO 2 - שלו כדי לתקן את אות הרקע. ניטריט הוא תגובתי ביותר עם זמן מחצית ...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

פעילות תחמוצת החנקן (NO) in vivo היא התוצאות המשולבות של השפעותיה הישירות, פעולת נגזרותיה הנוצרת מ- NO autoxidation, וההשפעות של תרכובות ניטרוסטיות. מדידת מטבוליטים ללא מטבוליטים חיונית לחקר פעילות NO הן ברמות כלי הדם והן ברקמות אחרות, במיוחד במסגרות הניסוי שבהן מנוהל NO אקסוגני. מבחני כימילומינסנציה מבוססי אוזון מאפשרים מדידות מדויקות של מטבוליטים NO ו-NO הן בנוזלים (כולל פלזמה, הומוגנטים של רקמות, תרביות תאים) והן בתערובות גזים (למשל, נשימה בנשיפה). NO מגיב עם אוזון כדי לייצר חנקן דו חמצני במצב נרגש. פליטת האור כתוצאה מכך מאפשרת פוטו-דטקציה ויצירת אות חשמלי המשקף את תוכן ה-NO של הדגימה. ניתן להשתמש באליקוטים מאותה דגימה כדי למדוד מטבוליטים ספציפיים של NO, כגון חנקה, ניטריט, S-nitrosothiols וקומפלקסים של ברזל-ניטרזיל. בנוסף, NO נצרך על ידי המוגלובין ללא תאים הוא גם כימות עם ניתוח chemiluminescence. המחשה של כל הטכניקות הללו מסופקת.

ה-NO-consumption על ידי בדיקת Hb ללא תאים שימשה בדגימות שהכילו ריכוזים ידועים של oxyHb ללא תאים (איור 4). כאשר heme אחד של oxyHb משחרר באופן סטויכיומטרי מולקולת NO אחת בבדיקה, oxyHb מטוהר ללא תאים משמש לבניית עקומת הכיול עבור הבדיקה (איור משלים 3).
הקשר בין מינון לתגובה ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לאיתור תחמוצת החנקן ונגזרותיה הרלוונטיות מבחינה ביולוגית באמצעות מבחנים מבוססי כימילומינסנציה בעלי רגישות גבוהה.

מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשתמש במיומנות בגלאי chemiluminescence למדידת מטבוליטים של תחמוצת החנקן ללא הדרכה או הוצאה של העסקת כוח אדם ייעודי באתר. בדיקה מבוססת Chemiluminescence היא השיטה הרגישה ביותר לזיהוי שינויים מינימליים ברמות של תחמוצת החנקן והמטבוליטים שלה בכל מדגם ביולוגי נתון. תחמוצת החנקן בשאיפה היא גז טיפולי המשמש למגוון רחב של מחלות.חיוני שהתקדמות המחלה וההחלמה שלה יהיו מתואמות במדויק עם רמות המטבוליט של תחמוצת החנקן. תחמוצת החנקן בשאיפה, אנטי מיקרוביאלית, מראה הבטחה בטיפול בחולים עם מחלות זיהומיות בדרכי הנשימה. שיטת chemiluminescence מספקת תובנה לגבי מינון קורלציה של תחמוצת החנקן והמטבוליטים שלה עם שינויים מיקרוביולוגיים ופתופיזיולוגיים.כדי להכין את תמיסת DETA-NONOate, הוסיפו 10 מיליגרם של DETA-NONOate ל-610 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד 10 מילימולרי ב-PBS של pH 7.4 כדי לייצר 100 מילימולר של DETA-NONOate ולשמור אותו על הקרח. כדי להמשיך, חבר את קו החמצן לגלאי chemiluminescence ופתח את מיכל החמצן בלחץ על פי הוראת היצרן המופיעה בטקסט. לאחר מכן, חברו את קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי לגלאי הכימילומינסנציה.בממשק גלאי chemiluminescence, התחל להריץ את תוכנית הגילוי לבדיקות פאזה נוזלית, תוך הקפדה על כך שאספקת החמצן מספקת והגלאי יתחיל לדגום, המציין זיהוי על ידי אות במיליוולטים, אחרת ינחה אות אבחון שלילי. כדי להכין את כלי הטיהור, סגור את כלי הטיהור בכל שלוש היציאות על ידי הברגה מלאה של שסתום המחט ימינה וסגירת הזין של תחנת הכניסה והיציאה. הסר את המכסה מכלי הטיהור.הוסף כמות מספקת של המגיב הספציפית לבדיקה המתוכננת לתא התגובה, כך שמחט המזרק המשמשת להזרקת הדגימות תוכל להגיע לעמודת הנוזלים תוך אימות נוכחות של קו בסיס יציב ורצוי. כדי להתחיל את זרימת גז הטיהור, ודא שמיכל הדלק האינרטי מצויד בווסת דו-שלבי, וחבר את מיכל הדלק האינרטי לכניסת הגז של כלי השיט. לאחר מכן, פתח את השקע של כלי הטיהור ופתח את הגז בלחץ יציאה בווסת של אחד עד חמישה פאונד לאינץ 'מרובע.לאחר מכן, פתח את הכניסה של כלי הטיהור ופתח באיטיות את שסתום המחט של כלי הטיהור כדי לאפשר זרימת גז ולאמת את המבעבע בתוך כלי הטיהור. כדי להתאים את זרימת הגז, רשמו את לחץ התא שנמדד על ידי גלאי הכימילומינסנציה עם קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי המדגים את אוויר הסביבה. מקם מחדש את המכסה על כלי הטיהור וחבר את קו המסנן הדיאלקטרי בעל השדה האינטנסיבי לכלי הטיהור.השתמש בשסתום המחט כדי להגיע לאותו לחץ תאי ברמת גלאי chemiluminescence המתועדת באוויר הסביבה. כדי להתחיל את תוכנית רכישת האותות chemiluminescence, חבר את היציאה הטורית של גלאי chemiluminescence ליציאה הטורית של המחשב שלתוכה הותקנה תוכנית הרכישה. לאחר מכן, הפעל את תוכנית הניתוח.לחץ על רכוש ולאחר מכן בחר את התיקיה כדי לשמור את קובץ הנתונים, הקלד את שם הקובץ ולחץ על שמור. בעת הכנה להזרקת דגימה, התאם את סולם המתח על המסך כך שתהיה לו שליטה על קו הבסיס הממוקד על-ידי לחיצה על הלחצנים המינימליים ו/או המקסימום ולאחר מכן הזנת הערך הרצוי. כדי לבצע את הזרקת הדגימה, שטפו את המזרק לפחות פעמיים או יותר במים שעברו דה-יוניזציה וזיקוק לפני משיכת כל דגימה, והבטיחו פליטת מים ללא הפרעה על גבי מגבון משימה.לאחר מכן, הכנס את המזרק לצינור הדגימה תוך החזקת המזרק והצינור במרחק קרוב ומשוך את הבוכנה לנפח הרצוי תוך הקפדה על כך שלא נלכדו בועת אוויר או חלקים מוצקים שאינם הומוגניים. נקו את קצה המזרק באמצעות מגב משימה והכניסו את המזרק למכסה הסטר ביציאת ההזרקה. לאחר אימות כי קצה המזרק נמצא בתוך השלב הנוזלי, להזריק את הדגימה לתוך תא התגובה.כדי לסמן את ההזרקה בתוכנה, הקלד את שם הדגימה על ידי לחיצה על התיבה האפורה תחת שמות לדוגמה, ולאחר מכן לחץ על Mark Injection תוך אימות שהזריקה גורמת לשינוי כלפי מעלה באות או כלפי מטה בצריכת תחמוצת החנקן על ידי בדיקת המוגלובין ללא תאים. הקשר בין תגובת המינון בין המוגלובין ללא תאים לבין צריכת תחמוצת החנקן נמדד באמצעות כימילומינסנציה לאחר מעקף לב-ריאה. ניתן להניח כי קיים ריכוז גבוה של קבוצות heme בסטטוס המחומצן של תחמוצת החנקן.בחולים המקבלים תחמוצת החנקן במהלך מעקף לב-ריאה, במקום זאת, רוב קבוצות ההם מופחתות ואינן צורכות תחמוצת החנקן. מדידות של ריכוז המוגלובין ללא תאים הצביעו על חיסול איטי של פלזמה תוך 12 שעות לאחר מעקף לב-ריאה. עם זאת, צריכת תחמוצת החנקן הגיעה לשיא של 15 דקות ולא שיקפה את חיסול ההמוגלובין ללא תאים.עקומות הרגרסיה הליניארית של צריכת תחמוצת החנקן על ידי המוגלובין ללא תאים הראו שכיחות של המוגלובין הנצרך תחמוצת מחומצנת ותחמוצת החנקן במשך 15 דקות, לעומת המוגלובין מופחת יותר בנקודת ההתחלה 4 שעות ו-12 שעות לאחר מעקף קרדיו-פולמונרי. ההשפעות של מתן גז תחמוצת החנקן על צריכת תחמוצת החנקן היו מנוטרות. כאשר המטופלים טופלו בגז תחמוצת החנקן תוך-ניתוחי ולאחר הניתוח, העלייה הנצפית של המוגלובין חופשי לאחר מעקף הלב-ריאה לא הוצמדה לעלייה כלשהי בצריכת תחמוצת החנקן.התוצאות הצביעו על כך שתחמוצת החנקן שניתנה באופן אקסוגני הפחיתה את רוב ההמוגלובין החופשי ומנעה טיהור תחמוצת החנקן. הניסוי תקף רק אם כל התנאים נשארים זהים. אם גובה רמת הנוזל עולה על עמודת התגובה, עלינו לעצור ולבצע כיול חדש.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

איתור Genogrouping של Noroviruses מ שרפרפים לילדים עד Taqman צעד אחד RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov הארת ההדמיה (CLI) לניטור ריפוי הסרטן

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Nephrectomy 5/6th בשילוב עם דיאטת מלח גבוהה ועיכוב תחמוצת החנקן synthase כדי לגרום למחלת כליות כרונית בחולדת לואיס

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

ג&#39;לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

תעוזה, תוקפנות, ואת מבחני Shoaling עבור תסמונות התנהגותיות דג הזברה

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

סינתזה, אפיון, ויישום של Nanoprobes תחמוצת ברזל Superמגנטית לאיתור שחפת הריאות חוץ

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

מערכת מסכת שאיפה חדשנית כדי לספק ריכוזים גבוהים של גז תחמוצת החנקן בנבדקים נושמים באופן ספונטני

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...