Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
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इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल को डॉ वॉरेन ज़पोल की प्रयोगशाला के पिछले अध्येताओं के संचित योगदान से संभव बनाया गया था, जो कि मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में एनेस्थीसिया विभाग के महत्वपूर्ण देखभाल में संज्ञाहरण अनुसंधान की प्रयोगशाला थी। हम Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, चोंग लेई, Yasuko Nagasaka, एस्टर Spagnolli और Emanuele Rezoagli के योगदान को स्वीकार करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में इंगित की गई प्रक्रियाएं मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के समीक्षा बोर्ड के अनुसार हैं। उपयोग किए गए रक्त के नमूने पिछले अध्ययन के दौरान एकत्र किए गए थे और वर्तमान उद्देश्यके लिए ड...

उच्च संवेदनशीलता के कारण, NO और संबंधित यौगिकों के निर्धारण के लिए chemiluminescence-आधारित assays में NO 2-संदूषण का उच्च जोखिम होता है। प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अभिकर्मक (विशेष रूप से NO2- अ?...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

विवो में नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) गतिविधि इसके प्रत्यक्ष प्रभावों के संयुक्त परिणाम हैं, NO autoxidation से उत्पन्न इसके डेरिवेटिव की कार्रवाई, और नाइट्रोसेटेड यौगिकों के प्रभाव। नो मेटाबोलाइट्स को मापना संवहनी स्तरों और अन्य ऊतकों दोनों में कोई गतिविधि का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से प्रयोगात्मक सेटिंग्स में जहां बहिर्जात NO प्रशासित किया जाता है। ओजोन-आधारित chemiluminescence assays दोनों तरल पदार्थ (प्लाज्मा, ऊतक homogenates, सेल संस्कृतियों सहित) और गैस मिश्रण (जैसे, साँस छोड़ने) में NO और NO मेटाबोलाइट्स के सटीक माप की अनुमति देते हैं। कोई भी एक उत्साहित राज्य में नाइट्रोजन डाइऑक्साइड उत्पन्न करने के लिए ओजोन के साथ प्रतिक्रिया करता है। परिणामस्वरूप प्रकाश उत्सर्जन फोटोडिटेक्शन और नमूने की कोई सामग्री को प्रतिबिंबित करने वाले एक इलेक्ट्रिक सिग्नल की पीढ़ी की अनुमति देता है। एक ही नमूने से एलीकोट का उपयोग विशिष्ट नो मेटाबोलाइट्स को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि नाइट्रेट, नाइट्राइट, एस-नाइट्रोसोथिओल्स, और आयरन-नाइट्रोसिल कॉम्प्लेक्स। इसके अलावा, सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन द्वारा उपभोग नहीं किया जाता है, यह भी chemiluminescence विश्लेषण के साथ परिमाणित किया जाता है। इन सभी तकनीकों का एक उदाहरण प्रदान किया गया है।

सेल-मुक्त एचबी परख द्वारा नो-खपत का उपयोग सेल-मुक्त ऑक्सीएचबी (चित्रा 4) की ज्ञात सांद्रता वाले नमूनों में किया गया था। के रूप में oxyHb stoichiometrically परख में एक अणु जारी की एक हीम के रूप में, शुद्ध सेल मु?...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

यहां, हम नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उच्च संवेदनशीलता के साथ केमिलुमिनेसेंस-आधारित assays का उपयोग करके इसके जैविक रूप से प्रासंगिक डेरिवेटिव।

नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए Chemiluminescence-आधारित Assays और Autoxidation और Nitrosated यौगिकों से इसके डेरिवेटिव

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को साइट पर समर्पित कर्मियों को नियोजित करने के मार्गदर्शन या खर्च के बिना नाइट्रिक ऑक्साइड मेटाबोलाइट्स के माप के लिए एक केमिल्यूमिनेसेंस डिटेक्टर का कुशलतासे उपयोग करने में सक्षम बनाता है। Chemiluminescence-आधारित परख नाइट्रिक ऑक्साइड और किसी भी दिए गए जैविक नमूने में इसके चयापचयों के स्तर में न्यूनतम परिवर्तन का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील विधि है। साँस नाइट्रिक ऑक्साइड एक चिकित्सीय गैस है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार की बीमारियों के लिए किया जाता है।यह महत्वपूर्ण है कि रोग की प्रगति और वसूली नाइट्रिक ऑक्साइड मेटाबोलाइट के स्तर के साथ सटीक रूप से सहसंबद्ध हो। साँस नाइट्रिक ऑक्साइड, एक रोगाणुरोधी, वायुमार्ग संक्रामक रोगों के साथ रोगियों के इलाज में वादा दिखाता है। chemiluminescence विधि नाइट्रिक ऑक्साइड खुराक और सूक्ष्मजीवविज्ञानी और pathophysiological परिवर्तनों के साथ इसके चयापचयों correlating में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।DETA-NONOate समाधान तैयार करने के लिए, DETA-NONOate के 100 millimolar उत्पन्न करने के लिए और इसे बर्फ पर रखने के लिए पीएच 7.4 के PBS में 10-millimolar सोडियम हाइड्रॉक्साइड के 610 माइक्रोलीटर में DETA-NONOate के 10 मिलीग्राम जोड़ें। आगे बढ़ने के लिए, ऑक्सीजन लाइन को chemiluminescence डिटेक्टर से कनेक्ट करें और पाठ में प्रदान किए गए निर्माता के निर्देश के अनुसार दबाव पर ऑक्सीजन टैंक खोलें। फिर, तीव्र क्षेत्र ढांकता हुआ फ़िल्टर लाइन chemiluminescence डिटेक्टर करने के लिए कनेक्ट करें।chemiluminescence डिटेक्टर इंटरफ़ेस पर, तरल चरण assays के लिए पता लगाने के कार्यक्रम को चलाने शुरू करते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऑक्सीजन की आपूर्ति पर्याप्त है और डिटेक्टर नमूना लेना शुरू कर देगा, millivolts में संकेत द्वारा पता लगाने का संकेत, अन्यथा एक नकारात्मक नैदानिक संकेत संकेत. शुद्ध पोत तैयार करने के लिए, सुई वाल्व को दाईं ओर पूरी तरह से खराब करके और इनलेट और आउटलेट स्टॉप कॉक्स को बंद करके सभी तीन बंदरगाहों पर पर्ज पोत को बंद करें। पर्ज पोत से टोपी निकालें।प्रतिक्रिया कक्ष के लिए नियोजित परख के लिए विशिष्ट अभिकर्मक की एक पर्याप्त मात्रा जोड़ें ताकि नमूनों को इंजेक्ट करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली सिरिंज सुई एक स्थिर, वांछित आधार रेखा की उपस्थिति को सत्यापित करते हुए द्रव स्तंभ तक पहुंच सके। पर्ज गैस प्रवाह शुरू करने के लिए, सुनिश्चित करें कि अक्रिय गैस टैंक दो-चरण नियामक से सुसज्जित है, और निष्क्रिय गैस टैंक को पोत के गैस इनलेट के साथ कनेक्ट करें। फिर, शुद्ध पोत के आउटलेट को खोलें और प्रति वर्ग इंच एक से पांच पाउंड के नियामक पर आउटलेट दबाव के साथ गैस खोलें।फिर, शुद्ध पोत के इनलेट को खोलें और गैस के प्रवाह की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे शुद्ध पोत के सुई वाल्व को खोलें और पर्ज पोत के भीतर बुदबुदाते हुए सत्यापित करें। गैस प्रवाह को समायोजित करने के लिए, तीव्र क्षेत्र ढांकता हुआ फिल्टर लाइन नमूना परिवेशी हवा के साथ chemiluminescence डिटेक्टर द्वारा मापा सेल दबाव रिकॉर्ड। पर्ज पोत पर टोपी reposition और तीव्र क्षेत्र ढांकता हुआ फिल्टर लाइन शुद्ध पोत करने के लिए कनेक्ट.सुई वाल्व का उपयोग करें chemiluminescence डिटेक्टर स्तर है कि परिवेशी हवा में दर्ज किया जाता है पर एक ही सेल दबाव तक पहुँचने के लिए। chemiluminescence सिग्नल अधिग्रहण कार्यक्रम शुरू करने के लिए, chemiluminescence डिटेक्टर के सीरियल पोर्ट को कंप्यूटर के सीरियल पोर्ट से कनेक्ट करें जिसमें अधिग्रहण प्रोग्राम स्थापित किया गया है। उसके बाद, विश्लेषण प्रोग्राम चलाएँ।अधिग्रहण पर क्लिक करें, फिर डेटा फ़ाइल को सहेजने के लिए फ़ोल्डर का चयन करें, फ़ाइल नाम लिखें, और सहेजें पर क्लिक करें। नमूना इंजेक्शन की तैयारी करते समय, न्यूनतम और / या अधिकतम बटन पर क्लिक करके लक्षित आधार रेखा पर नियंत्रण रखने के लिए स्क्रीन पर वोल्टेज पैमाने को समायोजित करें, और फिर वांछित मूल्य दर्ज करें। नमूना इंजेक्शन करने के लिए, प्रत्येक नमूने को वापस लेने से पहले विआयनीकृत और आसुत पानी के साथ सिरिंज को कम से कम दो बार या उससे अधिक कुल्ला करें, और एक कार्य पोंछने पर एक अबाधित पानी इजेक्शन सुनिश्चित करें।फिर, सिरिंज और ट्यूब दोनों को करीब से पकड़ते हुए नमूना ट्यूब में सिरिंज डालें और प्लंजर को वांछित मात्रा में खींचें, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई हवा का बुलबुला या गैर-होमोजेनाइज्ड ठोस भाग फंस गए हैं। एक कार्य वाइपर के साथ सिरिंज की नोक को साफ करें और इंजेक्शन पोर्ट पर सेटर कैप में सिरिंज डालें। यह सत्यापित करने के बाद कि सिरिंज की नोक तरल चरण के भीतर है, नमूना को प्रतिक्रिया कक्ष में इंजेक्ट करें।सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में इंजेक्शन को चिह्नित करने के लिए, नमूना नाम के तहत ग्रे बॉक्स पर क्लिक करके नमूना नाम लिखें, फिर मार्क इंजेक्शन पर क्लिक करें, जबकि यह सत्यापित करते हुए कि इंजेक्शन सिग्नल में ऊपर की ओर या सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन परख द्वारा नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत में नीचे की ओर परिवर्तन का कारण बनता है। सेल मुक्त हीमोग्लोबिन और नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत के बीच खुराक प्रतिक्रिया संबंध कार्डियोपल्मोनरी बाईपास के बाद chemiluminescence के माध्यम से मापा गया था। यह माना जा सकता है कि नाइट्रिक ऑक्साइड को मैला ढोने वाली ऑक्सीकरण स्थिति में हीम समूहों की एक उच्च सांद्रता है।कार्डियोपल्मोनरी बाईपास के दौरान नाइट्रिक ऑक्साइड प्राप्त करने वाले रोगियों में, इसके बजाय, अधिकांश हीम समूह कम हो जाते हैं और नाइट्रिक ऑक्साइड का उपभोग नहीं करते हैं। सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन एकाग्रता के माप ने कार्डियोपल्मोनरी बाईपास के बाद 12 घंटों के भीतर प्लाज्मा से धीमी गति से उन्मूलन का संकेत दिया। हालांकि, नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत 15 मिनट पर पहुंच गई और सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन के उन्मूलन को प्रतिबिंबित नहीं किया।सेल-मुक्त हीमोग्लोबिन द्वारा नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत के रैखिक प्रतिगमन वक्रों ने 15 मिनट में ऑक्सीकरण-और नाइट्रिक ऑक्साइड-खपत हीमोग्लोबिन के प्रसार का प्रदर्शन किया, जैसा कि बेसलाइन 4 घंटे और 12 घंटे पोस्ट-कार्डियोपल्मोनरी बाईपास पर अधिक कम हीमोग्लोबिन के विपरीत था। नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत पर नाइट्रिक ऑक्साइड गैस प्रशासन के प्रभावों की निगरानी की गई थी। जब रोगियों को नाइट्रिक ऑक्साइड गैस इंट्रा-और पोस्ट-ऑपरेटिव रूप से इलाज किया गया था, तो कार्डियोपल्मोनरी बाईपास के बाद मुक्त हीमोग्लोबिन की देखी गई वृद्धि नाइट्रिक ऑक्साइड की खपत में किसी भी वृद्धि के साथ युग्मित नहीं थी।परिणामों ने संकेत दिया कि बहिर्जात रूप से प्रशासित नाइट्रिक ऑक्साइड ने अधिकांश मुक्त हीमोग्लोबिन को कम कर दिया और नाइट्रिक ऑक्साइड स्कैवेंजिंग को रोका। प्रयोग केवल तभी मान्य होता है जब सभी शर्तें समान रहती हैं। यदि तरल स्तर की ऊंचाई प्रतिक्रिया स्तंभ से अधिक है, तो हमें एक नया अंशांकन रोकना और संचालित करना चाहिए।

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उच्च नमक आहार और लुईस चूहा में क्रोनिक किडनी रोग प्रेरित करने के लिए नाइट्रिक ऑक्साइड synthase निषेध के साथ संयोजन में 5/6th nephrectomy

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कैंसर की कोशिकाओं पर Invadopodia और कर्षण बल Assays के लिए polyacrylamide जैल

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

साहस, आक्रामकता, और Shoaling Zebrafish व्यवहार सिंड्रोम के लिए Assays

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

संश्लेषण, लक्षण वर्णन, और एक्स्ट्रापल्मोनरी तपेदिक का पता लगाने के लिए सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोप्रोब्स का आवेदन

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

प्लेटलेट आधारित वीएएसपी फास्फारिलीकरण को मापने के द्वारा रक्त में नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

अनायास श्वास विषयों में नाइट्रिक ऑक्साइड गैस की उच्च सांद्रता देने के लिए एक उपन्यास साँस लेना मुखौटा प्रणाली

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...